RNA和LNP生产

图4 优化的UTR改善mRNA表达效率。高斯荧光素酶mRNA使用不同的UTR组合表现出不同的表达水平。在12孔板中接种HEK293T细胞，细胞密度2.3×10⁵ 细胞/孔。每孔转染1 ug mRNA。转染后6 h、24 h、48 h、72 h以及96 h，取20 ul细胞测定高斯荧光素酶活性。

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图5 将miR-122靶向位点整合至3’ UTR 可降低肝脏特异性基因表达。分别向小鼠静脉注射在3’ UTR 含有或不含miR-122靶向位点的HiExpressTM萤火虫荧光素酶的LNP-mRNA，其中。对A和B两种不同设计的靶向位点进行测试。注射6小时从安乐死小鼠体内分离器官并检测荧光强度。结果显示miR-122在肝脏中高度特异性表达，而整合有miR-122靶向位点的肝脏组织其荧光素酶表达水平显著降低。

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图6 对编码序列进行密码子优化提高了mRNA的体外和体内表达水平。（A）HEK293T细胞中表达HiExpressTM萤火虫荧光素酶IVT mRNA以及其它版本的荧光素酶mRNA。细胞生长于12孔板，每孔转染0.5 ug mRNA。转染后6 h、24 h、48 h以及72 h测定荧光素酶活性。（B）向C57BL/6成年小鼠肌肉注射30 ug LNP包封的荧光素酶mRNA，注射后6 h、24 h、48 h测定荧光素酶活性。Fluc WT表示野生型荧光素酶mRNA。Fluc WT (co)表示经过密码子优化的荧光素酶mRNA。Fluc2表示luc2荧光素酶mRNA。HiExpressTM Fluc表示HiExpressTM萤火虫荧光素酶IVT mRNA。

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图7 polyA长度分析。使用核糖核酸酶将polyA尾巴从mRNA上切割下来，然后进行oligo dT亲和色谱纯化，LS-MS分析核苷酸信息。（A）基于尿素PAGE的polyA大小分析。变性尿素PAGE电泳mRNA酶切后的60 ng 120 nt和150 nt的polyA尾巴。（B）基于LC-MS 的polyA大小分析。逆卷积质谱图是由120 nt长度的120 p mol、预期长度为 120 nt的polyA尾生成的分子量的逆卷积质谱结果。（C）预期为120 nt的polyA尾巴长度观测分布。柱状图表明polyA长度的同一性较好。误差线表示3次酶切试验结果的标准偏差。polyA加权平均长度为123 nt。

图8 不同polyA尾巴长度和结构对翻译效率的影响。将具有不同长度的polyA尾，但是Cap1和UTR相同的IVT EGFP mRNA转染HEK293T细胞。polyA尾长度如上图所示。

图9 修饰的核苷酸增强mRNA表达，同时减少dsRNA产生。（A）293T细胞中使用IVT mRNA表达萤火虫荧光素酶。使用的mRNA包括无修饰的、N1-甲基假尿苷（N1-methylpseudouridine，m1Ψ）修饰的、5-甲基胞苷（5-methylcytidine，m5C）修饰的，以及m1Ψ/m5C修饰的。细胞生长于12孔板，每孔转染1 ug mRNA。293T细胞转染萤光素酶mRNA后6 h、24 h、48 h的萤光素酶活性。误差线表示标准偏差。平均荧光强度使用带颜色的柱状图表示。(B) 等量修饰的和无修饰的EGFP IVT mRNA（每斑点750 ng）经过磁柱纯化，使用斑点杂交估测dsRNA杂质含量。

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图10 变性凝胶电泳结果表明>10,000 nt的IVT mRNA其序列仍然高度完整。

图11 采用LC-MS对IVT mRNA分析加帽效率。（A）共转录法和（B）酶促法均能实现很高的加帽效率。

双链RNA（dsRNA）是体外转录过程的副产物，也是引发不良免疫原性的主要诱因。斑点杂交实验结果表明，可能需要额外的纯化步骤（如IP-PR实验）才能实现超纯化水平，同时将dsRNA含量降至极低水平。

图12 不同纯化方式的dsRNA去除效率。不同的纯化方式纯化等量的hSpCas9 IVT mRNA（每斑点1500 ng），然后使用斑点杂交估测残留dsRNA。缩写：HIC，Hydrophobic interaction chromatography；IP-RP，Ion-pair reversed-phase liquid chromatography。

图13 使用不同浓度的RNaseA分别孵育前体RNA和环状 EGFP RNA（circRNA-EGFP），然后进行凝胶电泳分析。RNaseA可消化所有线性RNA，但不消化环状RNA。

图14 LNP-mRNA的Cryo-TEM微观图。比例尺=100 nm。

图15 粒径和Zeta电势分析多分散指数（PDI）。（A）和Zeta电势（B）通过动态光散射（DLS）测定。该方法可以测量由粒子运动带来的散射光强度变化。数据反映了LNP混合物的同质性。

图16 对偶联抗CD31抗体的LNP-mRNA进行长期冷冻保存（153天）测试。（A）使用两种条件测试表达萤火虫荧光素酶的LNP-mRNA的保存效果：4℃、无添加剂；-80℃、7.5%蔗糖溶液。两组样品均测试了冷冻保存后的粒径（粉色柱子）和PDI（深蓝色点），并与其冷冻前的参数进行对比。（B）注射Fluc mRNA 6小时后的荧光图像。将以上两组经过冷冻保存的LNP-mRNA分别与PBS一同静脉注射雌性ICR小鼠。（C）经过冷冻保存后的LNP-mRNA封装效率。使用新鲜制备的 FLuc LNP-mRNA作为对照。（D）冷冻保存后，比较RNA的完整性。总体而言，我们的数据表明，抗体偶联的LNP-mRNA在-80℃、7.5%蔗糖溶液中经过长期冷冻保存，可以有效保持其颗粒均一性、封装效率，以及mRNA表达效果。

图18 使用LNP体外高效递送mRNA。使用LNP封装的EGFP mRNA和商业化转染试剂混合的EGFP mRNA分别转染细胞。（A）流式细胞术分析Jurkat和HEK293T细胞中的EGFP表达水平。（B）转染后24 h拍摄HEK293T细胞荧光图片。MFI：荧光强度中值。