治疗性IVT RNA开发

CRISPR-Cas9可以通过多种方法递送，包括质粒、重组病毒、gRNA-Cas9 RNP复合物，以及gRNA和Cas9 IVT mRNA的混合物，而这些方法都有各自的优势和局限性。研究人员应选择适合自己实验应用的递送方法，旨在通过最小化脱靶效应和不良效果获得最佳的编辑效率，而IVT RNA正迅速成为其中一种效果良好的基因编辑工具。

质粒的大量制备一般成本较低，并且可以通过技术相对简单的化学转染和电穿孔进行递送。然而，由于这些递送方式的自身特性，使得质粒载体主要限于体外应用。此外，质粒转染的效率在不同细胞类型之间差异很大，且转基因表达依赖于特定细胞类型的启动子活性，而这在某些系统中可能会降低转基因的表达效率。因此，质粒系统倾向配合使用高活性的启动子以确保Cas9的高水平表达，但是这也会增加脱靶效应和质粒DNA随机整合到宿主基因组中的风险。

重组病毒是递送CRISPR-Cas9的另一种常用工具，特别适合难以转染的细胞类型，并且可以创建稳定表达Cas9的细胞系以用于需要导入多个gRNA的实验。然而，该系统同样与质粒递送系统一样存在诸多相同的限制，包括依赖特定细胞类型的启动子，以及由于长期表达Cas9而导致的脱靶效应风险增加。此外，重组病毒也会带来较高的插入突变风险，特别是在逆转录病毒和慢病毒系统中的Cas9基因整合细胞基因组的时候。

通过gRNA-Cas9 RNP复合物递送可以绕过质粒和重组病毒系统的许多限制，同时实现快速编辑，因为不需要进行转录或翻译。然而，由于需要使用电穿孔方式实现高效的递送，这种方法同样主要限于体外应用。通过这种方法进行的基因编辑发生得很快，但随着Cas9在宿主细胞中被降解，编辑效果会迅速减弱，因此常受到可用的Cas9蛋白的类型限制。

与上述方法相比，使用gRNA和Cas9 IVT mRNA的混合物进行递送当前已被认为同样是一种高效的基因编辑方法，具有最小化脱靶效应的优点。该方法中，gRNA和Cas9 IVT mRNA一起被封装在脂质纳米颗粒或化学转染试剂中，使得该系统适用于体外和体内应用，并且无需担心存在整合宿主基因组的风险。此外，由于不需要进行转录，转基因的表达不依赖于特定的细胞类型启动子活性，翻译的发生也相对更快，从而实现快速且高效的基因编辑。与gRNA-Cas9 RNP复合物相比，mRNA形式的Cas9基因具有更长的表达时长，可达成充分的基因编辑效果。然而，mRNA最终也会被降解，编辑仅暂时发生过，从而限制了脱靶效应的影响。

总而言之，通过质粒、重组病毒和gRNA-Cas9 RNP复合物递送CRISPR-Cas9组分的方法均存在较多限制，对它们在许多场景中的应用造成了阻碍。这些方法具有明显的缺点，包括相对有限的编辑效率、较高的脱靶效应风险以及插入突变的潜在风险等。相对地，基于gRNA和Cas9 IVT mRNA混合物的递送方式具有诸多优点和较少的限制，是一种高效的基因编辑方法，应更多地被考虑用于基因编辑实验。

对于CRISPR介导的基因编辑，Cas9核酸酶通过特异性的gRNA作用至靶位点以产生DNA切割。在大多数情况下，为了实现简单的基因敲除，可以将单个gRNA与Cas9共同使用以产生DSB，然后通过NHEJ进行低效率的DNA修复，从而导致序列发生永久性突变，比如产生基因的小片段插入或碱基缺失。这类突变的一部分会导致基因的阅读框移码、出现提前终止密码子等，最终导致目的基因的功能丧失。

双gRNA则一般用于结合Cas9_D10A切口酶对靶位点的两条反向DNA链进行切割。在这种方法中，切口酶将在两条链上产生单链切割，每一条链上的切割位点通过两条gRNA中的一条引导，然后在靶位点产生DSB。一般来说，这种方法减少潜在的脱靶效应，因为该种DSB的产生要求两条gRNA同时靶向序列。

当使用Cas9_D10A切口酶和外源供体 DNA 模板将特定的碱基（例如敲入）引入感兴趣的基因时，也可以使用双gRNA。在这种方法中，两条反向的DNA链将被两个gRNA靶向位于所需突变位点两侧的两个位点，然后通过HDR途径利用外源DNA供体模板来修复切除的序列。