CRISPR基因编辑解决方案

CRISPR系统已在越来越多的实验中得到应用，每种CRISPR方法都至少由两个组分构成：一个Cas9蛋白以及向导RNA（gRNA）。最常用的Cas9来源于Streptococcus pyogenes细菌，是通过基因工程获得的（又名SpCas9，或着针对人类细胞进行密码子优化的hCas9）。它是一种 RNA 引导的 DNA 核酸酶，可以在靶位点产生DNA双链断裂 (DSB)（图1）。Cas9可通过与其互补配对的gRNA定位于宿主基因组的一个靶位点。当gRNA被设计用于靶向紧紧相邻原间隔区相邻基序（PAM）的区域时，就会引入DSB。PAM序列的选择取决于所使用的Cas酶类型：对于SpCas9而言，其对应的PAM序列为NGG或NAG（图1中的橙色DNA区域）。

图1 CRISPR引发的DNA修复产生基因敲除或精确序列变化的机制。

一旦通过CRISPR系统产生DSB，细胞通常会激活非同源末端连接 (NHEJ) 途径来修复DNA断裂，这通常会导致少量碱基的随机缺失，或者发生更罕见的碱基插入和碱基替换突变。当这些突变破坏了蛋白质编码区的序列时（例如发生移码突变），则可能引发功能性的基因敲除。双gRNA可以与Cas9一起引入以产生两个DSB，从而删除位于两个靶位点之间的DNA片段（图4），又或双gRNA可以用于同时靶向两个不同的基因。

另一种效率稍低的情况是，当引入DNA模板时，细胞可以通过同源重组修复 (HDR) 途径修复DSB。当供体DNA模板和CRISPR组件一同引入时，HDR可导致目标基因组DNA序列被供体序列替换，该机制有利于精确地改变DNA序列，例如产生点突变或在目标位点敲入供体DNA序列。供体DNA模板可以是单链寡核苷酸（ssODN）或dsDNA 片段（通常是来源于质粒或AAV的线性化DNA）。ssODN适用于引入点突变或小标签插入，而dsDNA片段则更适用于大片段敲入以实现转基因的靶向稳定整合。

另一种广泛使用的Cas9变体——Cas9“切口酶”（如Cas9（D10A）），能在DNA上产生单链切割。若将Cas9切口酶与gRNA结合使用，靶向同一目标区域两侧的两条互补链，切口酶会在两条链上各产生一个单链切割，致使目标区域周围形成大面积双链断裂(图2)。由于单链切口的修复具有高保真性，只有当两个错位的gRNA都正确结合时，才能实现高效切割并形成具有交错切口的DSB。因此，这种双切口策略在保持对多个位点高打靶效率的同时，能显著降低脱靶效应。

图2 切口酶结合2个gRNA后的酶切活性

失去催化活性的Cas9（dCas9）可以与不同形式的转录复合物结合以实现CRISPR介导的内源性基因转录调控。CRISPR介导的基因调控可用于多种应用，包括在染色质上测试调控元件、对目标细胞重编程，或用于全基因组筛选以识别促进增殖和分化的基因。

对于转录激活（CRISPRa），通常可使用协同激活介导系统（SAM）。该系统使用了三种组件：一个dCas9/VP64融合蛋白、一个MS2/P65/HSF1辅助蛋白复合体、以及一个经过修饰的gRNA（msgRNA）。dCas9蛋白经过改造结合了VP64，一种协同转录激活因子，而经过修饰的gRNA则含有一个MS2适配体，可以招募包含转录激活结构域NF-kB (p65)和HSF1的MS2复合物。总而言之，dCas9/VP64和MS2/P65/HSF1复合物协同作用，共同招募内源性的转录工具和辅助因子，从而激活靶基因表达，如图5所示。除了SAM系统，VectorBuilder还可以提供使用EB病毒R反式激活因子替换HSF1转录激活结构域的dCas9-VP64-p65-Rta（VPR）系统。已有报道表明，dCas9/VPR系统的内源性激活水平更高，但是dCas9/VP64由于较小的体积而更适合AAV载体系统。

相对的，如果需要抑制靶基因表达，dCas9也可以被改造为含有一个转录抑制结构域，如KRAB（krüppel-associated box）结构域和MeCP2。我们可提供两种dCas9/KRAB辅助载体：原始载体以及改造优化后的dCas9/KRAB/MeCP2载体。该改造版本将dCas9同时融合了两个转录抑制结构域KRAB/MeCP2，以便提供针对靶位点效果更强的转录抑制。KRAB结构域常在人的转录因子中被找到，是人类基因组中所发现的最常见的强效转录抑制因子之一。MeCP2可以通过招募组蛋白脱乙酰基酶，造成染色质凝聚和表观遗传抑制，进一步增强KRAB介导的转录抑制效果。当gRNA招募dCas9/KRAB/MeCP2到内源性启动子，如图6所示，转录被强力抑制。

CRISPR介导的基因组编辑或调控需要靶细胞同时表达Cas9和一个对靶位点特异的gRNA。无论应用何种方式，CRISPR组件必须被导入靶细胞。这些特定组件可通过以下不同途径进行转染或转导：

• gRNA和Cas9质粒
• gRNA和Cas9病毒（如慢病毒、AAV、腺病毒等）
• 混合的gRNA和Cas9 mRNA
• 由gRNA和Cas9蛋白组成的RNP复合物

图3总结了CRISPR基因递送的各种方法，图7、8、9和10中的案例研究展示了每种递送方法的有效性。

图3 将CRISPR组件递送到目标细胞的常用方法。

下表展示的是每种递送方式的优势与不足，可为您提供选择合适的CRISPR递送系统的相关参考：

VectorBuilder的线上CRISPR载体设计工具可提供针对人类、小鼠以及大鼠特征优化的全基因组gRNA数据库，旨在帮助您快速设计具有高打靶效率的CRISPR载体。我们仍在拓展我们的gRNA数据库，以囊括更多类型的Cas酶和更多的物种。我们的gRNA特异性评分计算遵循CRISPR文库设计（CLD）中的算法。简要而言，对于一个物种中的打靶N(20)NGG序列的一个给定的gRNA，我们搜索该物种基因组中的所有与靶序列比对≤3个错配碱基的潜在脱靶位点。以这种方式识别的每个潜在脱靶位点，都会计算一个脱靶分值。然后将所有脱靶位点的分值汇总用于计算gRNA的最终特异性分值，该数值介于0到100之间，值越高表示靶向特异性越强。请注意，特异性分值只是一个粗略的指导。实际的打靶效率和特异性可能与预测值不同。得分低的gRNA可能仍然有效。

当您在VectorBuilder的线上平台上设计CRISPR载体时，您可以在我们的数据库中搜索您的目标基因。输入基因名称后，您将在我们的数据库中看到针对您的目标基因的所有可用的gRNA的详细信息。

图4 使用gRNA/Cas9核糖核蛋白（RNP）方法，通过双gRNA删除DNA片段，生成纯合的靶基因敲除（KO）突变体。（A）编辑过的RNP复合物通过电转法导入靶细胞后可结合靶基因的两个位点以敲除一段长13 kb的区域，然后分离单克隆细胞并筛选。使用PCR和Sanger测序验证细胞的基因型。（B）在三个PCR反应中，使用了P1-P4四条引物以区分敲除和野生型克隆。（C）PCR结果验证了克隆1中的纯合敲除突变，并进一步在（D）靶基因测序结果中得到印证。

图5 利用基于慢病毒的CRISPRa系统上调基因的表达。向稳定表达dCas9/VP64和MS2/P65/HSF1 SAM复合物的NIH3T3细胞转导msgRNA表达慢病毒，然后进行药筛。（A）转录激活图示。（B）针对靶向小鼠mBrn2基因启动子区域而设计的msgRNA图示。（C）使用Scramble或打靶msgRNA分别转导NIH3T3细胞后与空白对照（NC）对比，用qRP-PCR测量Brn2基因的相对表达量。Mean±SD，*P<0.05，ANOVA结合Turkey事后检验。

图6 利用基于慢病毒的CRISPRi系统下调基因的表达。向稳定表达dCas9/KRAB/MeCP2的Jurkat 细胞转导表达gRNA的慢病毒，然后进行药筛。（A）转录抑制复合物图示。（B）靶向CXCR4基因启动子区的gRNA。（C）通过western blot显示了分别使用Scramble或gRNA转导的Jurkat细胞中以及空白对照组（NC）CXCR4蛋白质表达水平。（D）通过qRT-PCR测量CXCR4的相对基因表达。Mean±SD，***P<0.001，****P<0.0001，ANOVA之后进行Tukey事后检验。（E）流式细胞细胞术定量细胞表面表达的CXCR4。CXCR4使用单克隆一抗（Ab）和带有荧光基团的二抗来标记。未标记的和只标记二抗的Jurkat细胞均为阴性对照。（F）与转导scramble gRNA的细胞相比，转导了打靶CXCR4的gRNA的细胞其表面CXCR4数量减少了约50%。Mean±SD。

下列数种方法可用于将CRISPR组件递送至目的细胞中。每种方法均有其独特的优势和局限性。

1. gRNA和Cas9质粒
2. gRNA和Cas9病毒
3. gRNA和Cas9 mRNA的混合物
4. 含有gRNA和Cas9蛋白的RNP