痘苗病毒（VACV）

服务详情

服务类型

我们提供的VACV载体构建和病毒包装服务如下：

• 使用VACV BACYAC骨架克隆的VACV载体，包括WR毒株和MVA毒株
• VACV病毒包装

VACV载体克隆

云舟生物自主研发的“BACYAC”骨架专门为VACV载体克隆而设计。该骨架整合了细菌人工染色体（BAC）和酵母人工染色体（YAC）的关键元件。BAC相关元件允许该载体可以在大肠杆菌中以BAC形式扩增，而YAC相关元件允许该载体在酿酒酵母中复制BACYAC载体因此可灵活地在大肠杆菌系统和酵母系统中进行载体扩增和序列修饰。

EGFP/LacZ报告基因、BACYAC骨架序列、以及痘苗病毒启动子被克隆到J2R位点之间的TK（胸苷激酶）基因中，以获得减毒重组载体。我们的减毒WR毒株和MAV毒株可以被应用于基础科研、临床前试验、临床研究等领域。通过进一步直接突变改造，我们还可以提供减毒程度更高的痘苗病毒。

VACV BACYAC载体的基本设计如图1所示。

图1 含有EGFP或LacZ报告基因的VACV BACYAC骨架

TK：胸苷激酶基因，在重组VACV中失活以产生减毒病毒。

p7.5：痘苗病毒启动子。VACV在细胞质中复制需要痘苗病毒启动子。 p7.5 通常用于驱动转基因表达，因为它在病毒复制的早期和晚期具有转录活性。

LoxP：Cre重组酶作用的重组位点。两个LoxP之间的序列可以被Cre重组酶剪切下来。

ITR：痘苗病毒基因组两端的反向重复序列，带有VGF基因。

N2：N2基因在病毒早期感染时表达，抑制宿主免疫过程。

M1：M1基因可防止宿主细胞凋亡，增强病毒生产。

EGFP或LacZ报告基因： CMV启动子驱动表达的EGFP和LacZ报告基因，用于识别转染成功的细胞。

BACYAC骨架：整合了细菌人工染色体（BAC）和酵母人工染色体（YAC）的载体骨架，可以在大肠杆菌种携带氯霉素抗性基因选择性扩增，也可以在酿酒酵母中使用His3自噬选择标记进行扩增。

运输与存储

我们的VACV病毒保存于HBSS缓冲液，并以干冰形式运输。接收到病毒后，VACV可以在-80°C长期存储（可至少稳定存储6个月），或者在-20°C存储一周。VACV的保质期约为1年。请避免反复冻融VACV以避免显著的滴度下降。

VACV制备与质量控制

VACV包装流程如图2所示。携带目的基因的非感染性VACA BACYAC载体转染哺乳动物细胞，同时转导非复制型的鸡痘病毒作为辅助病毒。由于VACV具有广泛的组织嗜性，因此可用多种类型的细胞包装生产VACV。云舟生物首先采用多种类型的细胞用于VACV的复苏和扩增。我们使用嗜斑纯化法初步获得病毒克隆，然后进行病毒扩增。细胞外包膜病毒 (EEV) 和细胞内成熟病毒 (IMV) 可以分别从上清液和细胞裂解液中收获。EEV通过PEG浓缩后，与IMV的病毒液合并。对于超纯化VACV，病毒颗粒经过进一步的蔗糖密度梯度离心以获得纯化和浓缩。

图2 典型的VACV包装流程。

对于每一个生产的重组VACV病毒，质量控制包括滴度检测、无菌测试、支原体检测等。如果VACV病毒载体表达荧光蛋白，则我们会进行荧光转导测试。如果VACV病毒载体含有药筛标记，我们也会在转导测试后伴随进行药筛测试。此外，对于超纯化VACV，我们会进行内毒素检测。

试验验证

我们的VACV载体经详尽验证可以稳定用于生产活病毒。 图3显示了经我们性能验证的VACV病毒转导BHK21细胞的效果。

图3 表达EGFP的VACV转导BHK21细胞，MOI=0.5。转导后0小时和72小时使用荧光显微镜成像。放大倍数：100×。左：明场。右：EGFP。

VACV背景知识

VACV是一种双链线性DNA病毒，属于痘病毒家族。它的基因组长度约为190 kb，可以插入大型转基因（25-30 kb）。VACV的基因组复制和转录完全发生在宿主细胞的细胞质中，病毒基因组编码DNA复制和RNA转录所需的所有蛋白质。因此，VACV的病毒生命周期对宿主细胞机制的依赖非常小。

在病毒生命周期的早期阶段，会产生许多免疫调节蛋白，帮助病毒从宿主的病毒防御机制中逃脱。成熟的VACV主要有两种形式：在细胞裂解时释放的细胞内成熟病毒 (IMV) 和通过胞吐作用释放的细胞外包膜病毒 (EEV)。这两种形式都能够通过病毒脂质膜与宿主细胞膜的融合来感染宿主细胞，而无需与宿主细胞表面受体结合以进行感染。

VACV载体的主要应用

重组VACV载体对于基因治疗是一个富有前景的应用工具，它具有许多优点，比如良好的安全性、能够容纳很大的转基因、可以感染多种类型的宿主细胞、可以在增强宿主免疫反应的同时避免被宿主免疫系统靶向清除。

在痘病毒家族中，已经开发出具有不同感染性能和复制能力的多种毒株，这会影响它们在临床应用中的实际使用。两种非常常见的毒株是WR毒株和MVA毒株。虽然MVA由于其减毒特性而更常用于临床场景，但WR的优势在于具有更高的复制效率并且可以更大程度地调节宿主免疫系统。这两种毒株目前均被广泛用于科研和临床研究。以下是应用了VACV的一些主要研究方向：

肿瘤治疗

除了直接裂解肿瘤细胞，VACV还可以通过招募免疫细胞使其分泌细胞因子来改变肿瘤微环境，从而引发非直接的抗肿瘤免疫反应。为了保持VACV这种天然的优点并增强其安全性，重组VACV进行了特定的基因修饰。以Pexa-Vac溶瘤VACV为例，其减毒特性是通过删除病毒TK基因实现的，并且该病毒还表达GM-CSF转基因以增强宿主免疫反应。该病毒已经用于治疗多种实体瘤的临床探索。当前还存在其它几种溶瘤VACV的临床试验，可见VACV作为一种溶瘤治疗工具正在快速发展。

疫苗制备

VACV作为外源抗原递送系统也相当有效。VACV可以包装极大的DNA、作为天花疫苗具有很长的应用历史，这些特性使其有利于成为对抗多种疾病的有力疫苗载体，比如针对HIV和狂犬病。

VACV载体的应用优势

广泛的组织嗜性：VACV不具有用于感染特定细胞的表面蛋白，而是通过膜融合的方式感染细胞，使其可以侵入各种类型的包括分裂与非分裂细胞。

不整合宿主基因组：VACV的短生命周期只有8小时，且病毒复制全程在细胞质中进行，不具有病毒基因插入宿主基因组的风险。

肿瘤细胞中高复制效率：VACV在肿瘤细胞中可以选择性地高效率复制，导致肿瘤细胞裂解。

病毒复制机制独立：VACV的mRNA转录极少依赖宿主细胞的组分，使其可以适应不同类型的宿主细胞。

宿主免疫逃避：VACV具备逃避免疫系统攻击的能力，方式包括产生补体控制蛋白结合并抑制宿主白细胞，以及利用宿主细胞的细胞膜组分作为病毒的外包膜。因此VACV可以用于不同方式的注射方法从远端递送至靶组织或肿瘤位点。

极大的装载量：VACV具有很大的基因组，可以容纳的30 kb的外源基因。

高滴度且高感染性：VACV可以包装产生很高的滴度，同时具有良好的感染性，只需要很低的MOI即可成功转导。

视频

暂无

文档

暂无

常见问题解答