细菌基因组编辑

CRISPR/Cas9是一种广泛应用于各类生物（包括细菌）的基因组编辑工具。在许多细菌物种（如大肠杆菌）中，由于非同源末端连接（NHEJ）修复途径的效率低下，CRISPR诱导的双链断裂（DSB）将具有致死性。这一特性使CRISPR无需额外筛选标记即可实现强效的反向筛选。

图3 利用CRISPR基因编辑在细菌中创建点突变的模式图。编码Cas9和重组酶的质粒首先被导入细菌细胞，然后诱导λ Red蛋白的表达。随后将表达gRNA的质粒以及供体DNA导入表达有Cas9和重组酶的细胞。如果同源重组失败，则由Cas9引发的DSB将导致细胞死亡（右）。相对地，只有当细胞发生了供体DNA和基因组靶序列之间的同源重组时，细胞才能存活，从而实现所需的基因修饰（左）。

自杀质粒携带了包含所需编辑的同源序列，并被设计为仅在允许宿主中或在特定条件下才能复制。该特性一般可通过以下机制实现：使用反向筛选标记（比如赋予蔗糖敏感性的sacB基因）以及使用条件性复制系统（比如温度敏感型复制起点）。在允许条件下将质粒导入目标细菌后，整个质粒通过单次同源重组事件即可整合至宿主基因组。当环境转换为非允许条件时，未整合的质粒因无法复制而丢失（图4）。随后发生的第二次同源重组事件将质粒的骨架序列从基因组中去除，而此时可通过PCR筛选获得携带所需编辑的细胞。尽管该技术原理简单，但自杀质粒需要较长的同源臂，且存在较高假阳性风险，因此通常需要进行多轮筛选。

图4 使用包含温度敏感型复制起点的自杀质粒进行基因敲入的模式图。目的基因（GOI）以及筛选标记通过同源重组整合至基因组靶位点。通过抗生素筛选出的克隆进一步在非允许温度下培养，避免质粒复制。第二次重组事件发生将产生包含稳定整合或者基因组回退至野生型的两种克隆。对发生了敲入的克隆进一步筛选并使用PCR确认基因敲入。