AAV基因递送解决方案

AAV是一种无包膜病毒，其结构为一层蛋白质衣壳（图1B）包裹着一条长度约4.7 kb的单链DNA（ssDNA）基因组。AAV的病毒基因组编码多种蛋白质，其中非结构蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）负责基因组复制，结构蛋白（VP1、VP2和VP3）则形成60个亚基并进一步组装成二十面体衣壳。基因组同时还编码装配激活蛋白（AAP）和膜相关辅助蛋白（MAAP），可分别促进衣壳组装和病毒释放。此外，基因组两端的反向末端重复序列（ITR）可协助基因组复制以及将基因组包装进新的病毒颗粒（图1A）。

图1 野生型AAV的结构。AAV（A）基因组结构和（B）病毒颗粒结构。

AAV可以通过基因工程进行深度定制，将位于两个ITR之间的天然ssDNA基因组序列替换为用户自定义的DNA序列（图2），从而实现特定转基因的递送。

图2 重组AAV病毒颗粒。在重组病毒中，野生型病毒基因组序列被替换为特定的由用户选择的启动子驱动表达的转基因。

使用AAV作为病毒载体的一个主要优势在于，其天然存在的多种血清型可带来不同的组织嗜性（表1）。通过替换衣壳蛋白，可赋予重组病毒不同血清型，从而获得具有不同组织趋嗜性的AAV（图2）。此外，还可通过多种方法进一步增强AAV对特定组织和细胞的靶向能力。这些方法包括：采用衣壳定向进化技术生成新型衣壳变体；采用增强子/启动子筛选技术，构建适用于重组病毒基因组的新型调控元件以优化基因表达。这些方法可让AAV靶向难以到达的组织，比如神经科学研究中的脑组织，以及眼科学应用中的视网膜组织。

表1 不同的AAV血清型适用于靶向不同的细胞和组织类型。

野生型AAV与宿主细胞表面受体结合，经网格蛋白介导或其他形式的内吞作用进入细胞。在经过内体逃逸后，病毒或者被蛋白酶体靶向降解，或者被转运至细胞核进行脱壳和病毒基因组复制。作为一种依赖性细小病毒，AAV的病毒复制需要腺病毒或单纯疱疹病毒等辅助病毒提供特定因子。若无这些辅助因子，AAV将在宿主体内保持潜伏状态，以游离环状单体或多联体形式持续存在。

重组AAV具有与野生型相似的生命周期，但无法复制或产生新病毒颗粒。重组AAV基因组不编码病毒蛋白，而是携带并表达特定的转基因（图3）。对于单链AAV（ssAAV），病毒基因组为单链DNA形式，可经宿主细胞机制转化为双链DNA（dsDNA）。相比之下，自互补AAV（scAAV）经过基因工程改造，其基因组自身反向折叠形成双链DNA，因此绕过了宿主介导的第二链DNA合成这一限速步骤。虽然这种方式可以提高表达效率，但也使得载体容量从约4.2 kb减半至2.1 kb。重组AAV基因组在宿主细胞核内以游离体形式存在，可在非分裂细胞中持续存在，或者在分裂细胞中被稀释掉。在核内的转录完成后，AAV mRNA被转运至细胞质进行翻译以产生转基因蛋白，或者被转运至细胞质进行加工和调控（图3）。

图3 重组AAV的生命周期。

三质粒转染法被广泛用于重组AAV生产。该方法需要共转染三种质粒：编码用户选定目的基因（GOI）的转移质粒；编码复制蛋白（Rep）和决定血清型的衣壳蛋白（Cap）的Rep/Cap质粒；以及编码复制必须的腺病毒因子（E4、E2A和VA）的辅助质粒。将这些质粒共转染至包装细胞系比如HEK293T（表达E1A/E1B）后，视血清型的差异可从细胞裂解产物或上清液中收获病毒颗粒。在进一步的浓缩和纯化后（如采用氯化铯梯度超速离心法），这些病毒可根据不同的下游基因递送应用场景来进行相应的质量检测。

图4 AAV病毒包装的三质粒转染法。