云舟生物提供用于RNA和质粒基因递送的脂质纳米颗粒（LNP）封装服务。我们制备的高均一度LNP可达到很高的封装效率。此外，我们还可以通过制备抗体偶联的LNP或优化LNP配方来提高LNP的基因递送效率和靶向性。如果您需要规模化生产LNP-RNA药物，请查看我们的CDMO服务。
关于治疗性IVT RNA的更多详情，请访问我们的治疗性IVT RNA开发服务。您也可以查看我们的预制LNP-RNA产品。
云舟生物提供多种QC方法检测RNA和质粒的LNP封装质量。
| 性质 | QC试验 | 科研级 | GMP-like |
| 外观 | 目视检测 | √ | √ |
| 浓度 | RiboGreen试验 | √ | √ |
| 封装效率 | RiboGreen试验 | √ | √ |
| 粒径 | 动态光散射（Zetasizer） | √ | √ |
| 多分散指数（PDI） | 动态光散射（Zetasizer） | √ | √ |
| 表明电荷（Zeta电势） | 动态光散射（Zetasizer） | √ | √ |
| 封装的RNA完整性 | 毛细管电泳（CGE） | 可选 | √ |
| 内毒素 | 动态显色法（KCA） | 可选 | √ |
| pH | pH试纸 | 可选 | √ |
| 无菌性 | 生物负荷测试 | 可选 | √ |
冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）结果显示我们封装的LNP-mRNA结构完整且大小均一。
图1 冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）视野下的LNP-mRNA。LNP保存于-80℃含有蔗糖的Tris溶液（pH7.4），冰上解冻后拍摄。比例尺=100 nm。
动态光散射（DLS）分析表明我们的LNP-mRNA可以达到很低的PDI值（PDI<0.1）。云舟生物承诺我们的LNP-mRNA的Zeta电势范围在-10 mV至+10 mV之间。
图2 LNP粒径和Zeta电势分析多分散指数（PDI）。（A）和Zeta电势（B）通过动态光散射（DLS）测定。该方法可以测量粒子运动带来的散射光强度的波动变化。反映的则是样本中的粒子尺寸的异质性。样本中的Zeta电势范围在-1.872到+1.872 mV之间。
图3. 对偶联有anti-CD31的LNP-mRNA进行长期冷冻保存（153天）测试。（A）使用两种条件测试表达萤火虫荧光素酶的LNP-mRNA的保存效果：4℃、无添加剂；-80℃、7.5%蔗糖溶液。两组样品均测试了冷冻保存后的粒径（粉色柱子）和PDI（深蓝色点），并与其冷冻前的参数进行对比。（B）注射Fluc mRNA 6小时后的荧光图像。将以上两组经过冷冻保存的LNP-mRNA分别与PBS一同静脉注射雌性ICR小鼠。（C）经过冷冻保存后的LNP-mRNA封装效率。使用新鲜制备的 FLuc LNP-mRNA作为对照。（D）冷冻保存后，比较RNA的完整性。总体而言，我们的数据表明，抗体偶联的LNP-mRNA在-80℃、7.5%蔗糖溶液中经过长期冷冻保存，可以有效保持其颗粒均一性、封装效率，以及mRNA表达效果。
图4 使用LNP高效递送mRNA。对比使用传统转染试剂，LNP封装的EGFP mRNA表现出更高递送效率。向Jurkat和293T细胞转染1 ug的EGFP mRNA：（A）流式细胞术分析EGFP表达水平。（B）转染后24 h拍摄细胞荧光图片。实验中使用的EGFP mRNA均无核苷修饰。 荧光强度中值表示为MFI。
图5 鼠转导萤光素酶mRNA（Luc mRNA），检测mRNA表达情况和免疫反应。（A）注射后6 h、24h、和48 h通过活体成像检测萤光素酶活性。 （B）为量化外源RNA在小鼠中引发的炎症反应，注射后48小时检测小鼠血清中两种促炎细胞因子IL-6和TNF-α的浓度。 误差线表示标准偏差。小鼠种系：C57BL/6J；小鼠年龄：8周；注射方法：肌肉注射。（C）向Balb/C小鼠注射30 ug的LNP封装的mRNA，注射后14天，分离Balb/C小鼠的脾脏细胞，针对病毒抗原A、病毒抗原B以及PBS对照进行IFN-γ ELISpot试验。
图6 EGFP mRNA转染原代T细胞。（A）转染后24小时，流式细胞术测定表达EGFP的细胞数。无处理对照（NC）、商业转染试剂封装的mRNA、以及LNP封装的mRNA均分别转染了原代T细胞。（B）通过流式细胞术测量的EGFP阳性细胞的百分比（灰色）和经过量化的对应的中位荧光强度（黑色）。
图7 使用VectorBuilder的LNP-mRNA体系制备人源CAR-T细胞，实验结果显示出其对CD19⁺细胞具有细胞毒性。(A)使用脂质纳米颗粒（LNP）将抗CD19CAR的mRNA封装，再将其转染进原代人T细胞，随后把这些CAR-T细胞与CD19⁺Raji细胞共孵育，通过检测释放的乳酸脱氢酶（LDH）来验证其杀伤功能。（B）分别编码带有不同共刺激结构域4-1BB（CD19-BBz,1949nt）或CD28（CD19-28z,1931nt）的抗CD19CAR的IVTmRNA被包封进LNP。（C）活化的人T细胞用对应的LNP-mRNA转染后，检测其表面CD19CAR的表达以验证转染效果。（D）将CAR-T细胞与Raji细胞以不同效靶（E:T）比例共孵育18小时后，通过LDH测定法检测T细胞诱导的细胞毒性。
图7 表达萤火虫荧光素酶（FLuc）的LNP-mRNA在偶联anti-CD31抗体后在肺部的表达效率提升。小鼠品系：C57BC/6J ；小鼠年龄：6-8周；小鼠性别：雌性；注射途径：尾静脉注射；对照：IgG2a偶联的Fluc-mRNA。
图8 LNP配方优化可提高质粒体外转染效率。（A）表达EGFP的质粒（pDNA-CMV>EGFP）分别采用SM102和ALC-0315两种LNP封装，转染HEK293T细胞。转染后24 h拍摄EGFP荧光图像。（B）基于SM102优化的配方可以获得相较于商业化PEI转染试剂高约6.6倍的转染效率。该实验中的质粒（pDNA-CMV>Fluc）表达萤火虫荧光素酶报告基因。
图9 采用云舟生物新型LNP配方封装萤火虫荧光素酶报告基因表达质粒（pDNA-CAG>Luc+），按照0.6 mg每千克体重静脉注射小鼠。注射后96 h观察萤火虫荧光素酶报告基因表达情况。
图10 使用抗体偶联的纳米脂质颗粒（LNP）实现组织特异性的mRNA递送。（A）向两组携带有Cre依赖的tdTomato表达盒的Ai9小鼠各自静脉注射特定类型的LNP封装的Cre mRNA（0.4 mg/kg）。其中一种LNP经过anti-CD31抗体偶联，另一种则无抗体偶联。（B）注射后72 h，观察肺部tdTomato表达效果。
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