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慢病毒包装

慢病毒(Lentivirus)是一种应用广泛的转基因载体,对于分裂和非分裂的哺乳动物细胞,都能有效地传递外源遗传物质,并最终整合进细胞基因组。我们开发出一系列专有技术和试剂,从病毒滴度、纯度、活性以及一致性等方面显著提升了慢病毒包装工艺水平,对于在我们载体构建服务中用到的第三代慢病毒载体尤其如此。因此,结合我们的线上载体设计平台、线下载体和病毒生产线,我们能持续地提供高质量的定制化慢病毒产品。

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慢病毒类型

我们提供VSV-G假病毒化的二代和三代慢病毒包装服务。同时,我们也可以包装非整合型慢病毒(Integrase-defective Lentivirus ,简称IDLV)

价格和周期

由于技术上的优势,我们的慢病毒包装具有更高的质量、更高效、更实惠。不同规格的慢病毒包装价格和周期如下所示:

规格 推荐使用 滴度 & 体积* 价格 (CNY) 周期**
小规格 细胞培养 >108 TU/ml,10x 25 ul,HBSS 缓冲液 ¥3100 7-14天
中规格 细胞培养 >108 TU/ml,10x 100 ul,HBSS 缓冲液 ¥4600 7-14天
大规格 细胞培养 >109 TU/ml,10x 100 ul,HBSS 缓冲液 ¥7700 7-14天
中规格和超纯化 动物体内 >109 TU/ml,10x 50 ul,HBSS 缓冲液 ¥9300 7-14天
大规格和超纯化 动物体内 >109 TU/ml,10x 100 ul,HBSS 缓冲液 ¥11600 7-14天

*我们的滴度保证仅适用于包装进病毒的区域(从5’ LTR的R元件的第一个碱基到3’ LTR的R元件的最后一个碱基)小于慢病毒承载限度(9.2 kb,~野生型HIV-1基因组长度)的载体。超过该范围,载体也许会被包装进病毒,但会造成病毒滴度降低。此外,对于如下载体,我们同样不能保证滴度:

  • 包含对包装过程有不利影响的序列,例如毒性基因(如促凋亡基因、针对HIV的host factors);破坏包装细胞或病毒的完整性(如导致细胞聚集的膜蛋白、含有polyA信号序列)的基因;易于重排或者产生二级结构的序列(如重复序列或者高GC含量序列)。
  • 用户提供的载体,因为我们无法控制载体质量。

**周期是指订单接收到发货之间的时间,不包括需要客户提供任何物料(如病毒载体)的等待时间。

交付内容

如果您选择非超纯化慢病毒包装(体外应用级别),如小规格、中规格和大规格,每个订单交付内容如下:

  • 所选规格的定制慢病毒
  • 免费:少量对照病毒*
  • 免费:Polybrene(5 mg/ml,200 ul)
  • 附加购买(可选): 等量的辅助病毒**

如果您选择超纯化慢病毒包装(体内应用级别),如中规格和超纯化、大规格和超纯化,每个订单交付内容如下:

  • 所选规格的定制慢病毒
  • 附加购买(可选): 等量的对照病毒*
  • 免费:Polybrene(5 mg/ml,200 ul)
  • 附加购买(可选): 等量的辅助病毒**

* 对照病毒的设计与定制化病毒的生物学应用相匹配,并用于转导测试。例如,如果定制化的病毒过表达一个基因,则提供的对照病毒表达荧光蛋白EGFP;如果定制化病毒表达打靶某个基因的shRNA,则对照病毒表达一个scramble shRNA。对照病毒详细信息如下表所示。

** 辅助病毒的设计与定制化病毒的生物学应用相匹配。例如,如果定制化的病毒是一个TetOn慢病毒(只含有TRE启动子基因盒子),则需要一个表达rtTA的辅助病毒,才能进行诱导表达实验。

载体系统 对照载体名称 对照载体ID 定制病毒包装规格 对照病毒数量 价格(CNY)
慢病毒基因表达 pLV[Exp]-
EGFP:T2A:
Puro-EF1A>
mCherry
VB160109-10005 小规格 >108 TU/ml,100 ul,HBSS缓冲液 免费
中规格 >108 TU/ml,2x 100 ul,HBSS缓冲液 免费
大规格 >108 TU/ml,2x 100 ul,HBSS缓冲液 免费
中规格和超纯化 >109 TU/ml,10x 50 ul,HBSS缓冲液 ¥3000
大规格和超纯化 >109 TU/ml,10x 100 ul,HBSS缓冲液 ¥3800
慢病毒shRNA
干扰载体
pLV[shRNA]-EGFP:T2A:
Puro-U6>
Scramble
_shRNA
VB151023-10034 同上 同上 同上
慢病毒miR30-shRNA
干扰载体
pLV[miR30]-EGFP/Puro-EF1A>mCherry:
Scramble_
miR30-shRNA
VB180124-1174nde 同上 同上 同上
慢病毒CRISPR
系统
pLV[Exp]-
EGFP:T2A:
Puro-EF1A>
mCherry
VB160109-10005 同上 同上 同上
生产、纯化和滴定

我们常规使用的第三代慢病毒包装系统包括1个转移质粒(Transfer plasmid)、1个膜蛋白表达质粒(Envelope plasmid)、2个包装质粒(Packaging plasmids),其包装流程是将携带目的基因(Gene of Interest,简称GOI)的转移质粒、VSV-G包膜蛋白表达质粒和2个包装质粒(Gag/Pol表达质粒和Rev表达质粒)共转染包装细胞。短暂孵育后,收集上清,离心去除细胞碎片,再过滤,接着通过PEG浓缩病毒颗粒。对于超纯化慢病毒(体内应用级别),采用蔗糖离心方法进一步纯化、浓缩病毒。我们常规采用p24 ELISA方法测定慢病毒滴度。

注意:第三代慢病毒包装系统只能包装第三代的慢病毒转移载体。但是第二代慢病毒包装系统既能包装第二代,也能包装第三代的慢病毒转移载体。第三代慢病毒转移载体上的5’ LTR中的U3元件是被一个外源启动子替代(如CMV启动子或者RSV启动子),使其不依赖Tat蛋白进行HIV RNA基因组的转录,故第三代慢病毒包装系统的包装质粒不含Tat蛋白。第二代慢病毒转移载体上的5’ LTR是野生型的LTR,含有U3、R和U5元件,依赖Tat蛋白转录HIV RNA基因组,故第二代慢病毒包装系统的包装质粒含有Tat蛋白。

质量控制

对于每一个我们生产的慢病毒,质量控制均包括滴度测定(Titer determination)、微生物(细菌和真菌)检测(Bioburden test)、支原体检测(Mycoplasma test)。若转移载体同时编码一个荧光蛋白,我们还会将病毒进行细胞转导以测定相应的荧光表达情况(Transduction test)。此外,对于超纯化慢病毒,我们还可以检测内毒素水平(Endotoxin test)。

客户提供载体

如需客户提供慢病毒载体,则请按照外来物品接收指南将载体寄送给我们。请严格按照我们的指南来进行装运以免造成物品的任何延误和损坏。客户提供的所有材料均需经过QC检测,每一份材料附加检测费用。请注意,客户提供物品接收并通过QC之后生产才正式开始。

问题

常见技术问题请参见常见问题。有关我们产品和服务的其他更多信息,请按照此处联系方式咨询载体家产品服务团队。