云舟生物可为您定制个性化的CRISPR或shRNA文库来进行大规模的功能性筛选研究。我们在构建高质量的文库上拥有丰富的经验，使用的载体均经过高度优化。根据您的需要，我们可以把构建的文库转化大肠杆菌，也可以采用DNA或病毒的形式给您发货。我们定制的文库都会进行NGS测序验证以确定文库的质量。
我们提供的文库构建服务类型：
| 服务 | 简述 | 价格(CNY) | 周期 |
|---|---|---|---|
| 设计文库构建策略* | 1-4 天 | ||
| 构建CRISPR/shRNA文库 | 包括gRNA/shRNA 引物芯片的合成、将gRNA/shRNA克隆到所需的载体骨架中以及NGS测序验证质粒文库。** | ￥10,500起 | 2-3 周 |
| 预制文库质粒扩增**** | 如果您提供制备好的质粒库（例如从Addgene购买的CRISPR质粒库），我们可以提供病毒包装服务。我们需要将质粒库转化大肠杆菌，使得每个质粒具有平均>100x的覆盖率，然后制备足量的质粒DNA以备进行病毒包装。** | ￥2,100起 | 3-5 天 |
| 文库质粒DNA制备 | >1 ug/ul，150 ul，1x TE缓冲液，去内毒素、无菌 | ￥880 | 4-6 天 |
| 文库的病毒包装 | 了解更多病毒包装服务信息>>*** | ||
| 预制质粒DNA文库的NGS测序分析**** | 我们可以在扩增之前和/或之后通过NGS验证您提供的质粒DNA文库质量。包括质粒库NGS样品的制备、Illumina测序（> 500x覆盖率）和数据分析。 | ￥2,100起/样本 | 1-2 周 |
| 功能筛选样品的NGS测序分析 | 包括细胞样品基因组的NGS文库制备、llumina测序（> 500x覆盖率）和数据分析。 | ￥2,940起/样本 | 3-5 周 |
* 如果需要我们设计gRNA或shRNA，项目的周期可能会更长。
** 默认交付形式是包含文库的大肠杆菌甘油菌。
*** 文库质粒的病毒病毒包装价格更高，是常规单质粒载体包装的1.5倍。
**** 对于用户提供的预制质粒DNA文库，我们不能保证文库的多样性和均一性。
CRISPR/shRNA文库及其在遗传筛选中的应用
CRISPR文库
CRISPR文库是一个强大的用于编码或非编码区域的大规模或全基因组功能筛选工具，可涉及特殊通路、疾病、细胞药物应答、发育、基因调控等。下表列出并比较了常用的基于CRISPR文库的筛选类型：
| 筛选类型 | 原理 | 靶向位置 | 应用 |
|---|---|---|---|
| 基因敲除 | 利用野生型Cas9或Cas9缺刻酶切割DNA。当细胞自身发生随机修复时，可以在靶位点引入随机突变。 | 通常是编码区域 | 主要用于编码基因的功能筛选 |
| CRISPRa（基因激活） | 转录激活功能域（如VP64）融合无催化活性的Cas9（dCas9），用于激活靶位点调节基因表达。 | 通常是启动子区和其他非编码调控区 | 主要用于编码基因的功能获得筛选或非编码区域的调控功能筛选 |
| CRISPRi（基因抑制/沉默） | 转录阻遏物（如KRAB）融合无催化活性的Cas9（dCas9），用于抑制靶位点调节基因表达。 | 通常是启动子区和其他非编码调控区 | 编码基因的功能缺失筛选或非编码区域的调控功能筛选 |
除构建定制CRISPR文库外，我们还提供高质量的预制dual-gRNA文库，可打靶人类或者小鼠基因。我们的人和小鼠dual-gRNA慢病毒预制文库可分别打靶20,048个人类基因和20,493个小鼠基因。每个基因被4-6对位于不同载体上的gRNA靶向。这些文库均经过NGS测序和功能验证。
shRNA文库
shRNA文库可以在哺乳动物细胞中进行大规模或全基因组功能缺失筛选，是一个强大且经济实惠的工具。CRISPR基因敲除筛选的主要缺点是CRISPR会引入随机突变，使得针对给定靶位点的敲除效应在不同的细胞间差异较大。相比之下，shRNA文库的筛选对于特定靶基因的干扰效应，在不同细胞间的表现通常较为均一。
除了构建定制的shRNA文库之外，我们还提供高质量的针对人和小鼠基因的shRNA文库产品。对于每个物种，我们提供了两种规格的慢病毒shRNA文库产品：全基因组大库（针对约19,000个RefSeq基因）和精华基因小库（针对PubMed Central上约2,000个最常被引用的基因），每个基因对应5-6个不同的shRNA。我们的shRNA文库已通过了NGS测序和功能验证。
文库构建流程
设计文库构建方案
我们拥有强大的计算机资源和优化的流程。如果您没有备选的gRNA或shRNA序列，我们可以为您设计。您可根据研究需要，选择我们经过验证的载体骨架来构建文库，如慢病毒，腺相关病毒（AAV），piggyBac和常规质粒等。对于2-载体系统的CRISPR文库，我们还可以根据您的筛选策略，设计和构建相应的Cas9或Cas9变体表达载体。
构建CRISPR/shRNA文库
我们使用芯片合成的方法获得高质量的gRNA或shRNA引物库。以引物库为模板，使用最低有效循环数进行PCR扩增，并以平均100x的覆盖率克隆到目的载体骨架上。将CRISPR/shRNA文库质粒DNA转化大肠杆菌进行扩增培养后，取对数生长期的菌液制备成甘油菌进行保存。为了评估文库的质量，我们会对gRNA/shRNA质粒DNA库进行NGS测序分析，测序深度将达到>500x覆盖率，分析出来的数据将形成报告。
预制质粒DNA文库的扩增
我们可以为您扩增其他来源（例如Addgene）的预制质粒DNA文库。首先我们会将质粒DNA文库转化超级感受态细胞，达到>100x覆盖率，取对数生长期的大肠杆菌培养物制备成甘油菌。其次，我们还会对转化后的菌落进行计数以评估gRNA/shRNA实际平均数量。我们也提供质粒DNA文库的大提和病毒包装服务。
我们可以在转化前和/或转化后对您的质粒DNA文库进行NGS测序验证。对于您提供的质粒DNA文库，我们可以通过克隆计数保证达到100x覆盖率，但不能保证文库的多样性和均一性，因为我们无法控制您的预制质粒DNA库质量。
文库的病毒包装
对于CRISPR/shRNA文库筛选，您可能需要通过病毒（如慢病毒或腺相关病毒）将文库转到细胞中。我们研发出了一系列专利技术和试剂，大大改进了病毒包装的滴度、纯度、活性和均一性等。针对我们的病毒载体系统，我们也优化了病毒包装方法。因此，我们的客户满意度越来越高，客户群体越来越大，并且有很多发展成了长期合作的老客户。
功能筛选样品的NGS测序分析
功能筛选后，不知道如何对细胞样品进行NGS数据分析？您可以直接将基因组DNA样品寄送给VectorBuilder，我们将为您制备NGS样品、高通量测序和数据分析，并在短短几周内告知您样品的gRNA/shRNA的分布情况。
测序完成后，我们会通过电子邮件通知您，并给您发送用于下载原始测序数据和数据分析报告的FTP链接。您的数据将免费保存3个月，您也可以申请延长存储数据的时间。
客户提供文库质粒
如果您需要使用您的文库质粒构建文库，请按照外来物品接收指南将质粒寄送给我们。请严格按照我们的指南来进行装运以免造成物品的任何延误和损坏。客户提供的所有材料均需经过QC检测，每一份材料附加检测费用。请注意，客户提供物品接收并通过QC之后生产才正式开始。对于使用客户文库质粒构建的文库，我们无法保证文库的多样性和均一性。
暂无
对于CRISPR介导的基因编辑，Cas9核酸酶通过特异性的gRNA作用至靶位点以产生DNA切割。在大多数情况下，为了实现简单的基因敲除，可以将单个gRNA与Cas9共同使用以产生DSB，然后通过NHEJ进行低效率的DNA修复，从而导致序列发生永久性突变，比如产生基因的小片段插入或碱基缺失。这类突变的一部分会导致基因的阅读框移码、出现提前终止密码子等，最终导致目的基因的功能丧失。
双gRNA则一般用于结合Cas9(D10A)切口酶对靶位点的两条反向DNA链进行切割。在这种方法中，切口酶将在两条链上产生单链切割，每一条链上的切割位点通过两条gRNA中的一条引导，然后在靶位点产生DSB。一般来说，这种方法减少潜在的脱靶效应，因为该种DSB的产生要求两条gRNA同时靶向序列。
当使用Cas9(D10A)切口酶和外源供体 DNA 模板将特定的碱基（例如敲入）引入感兴趣的基因时，也可以使用双gRNA。在这种方法中，两条反向的DNA链将被两个gRNA靶向位于所需突变位点两侧的两个位点，然后通过HDR途径利用外源DNA供体模板来修复切除的序列。
对于典型的基因敲除筛选，CRISPR文库可以使用两种骨架进行构建，分别是1-载体系统和2-载体系统。在1-载体系统中，Cas9或Cas9变体与gRNA共表达，即两者在同一骨架上；而在2-载体系统中，Cas9或Cas9变体和gRNA分别在不同的载体上表达；或是表达gRNA的载体导入稳定表达Cas9的细胞系中。1-载体系统的优点是不需要两种载体共转染或转导到细胞，而且可以在非Cas9稳定表达的细胞系使用。但是，它的克隆效率和病毒包装效率比2-载体系统低，通用性也较差。
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