云舟生物专注于高度复杂的CRISPR文库设计，以满足各种大规模和小规模功能筛选的实验需求。CRISPR文库可以以E. coli菌株、质粒DNA或重组病毒的形式交付。我们使用下一代测序（NGS）全面验证定制文库，能让您真正了解所购买文库的组分和质量。
亮点
表1 文库构建服务价格与周期
| 服务 | 简述 | 价格（CNY） | 周期 |
|---|---|---|---|
| 设计文库构建策略 | CRISPR载体骨架设计、gRNA序列设计 | 免费 | 1-4 天 |
| 文库质粒克隆（包括oligo合成和NGS验证） | 见表2。 | ||
| 文库的病毒包装 | 点击此处了解更多病毒包装服务信息。文库质粒的病毒病毒包装价格是常规单质粒载体包装的1.5倍。 | ||
| 功能筛选样品的NGS测序分析 | 包括细胞样品基因组的NGS文库制备、llumina测序（>500×覆盖率）和数据分析。 | ￥ 2,240/样本 | 3-5 周 |
CRISPR文库是一种强大的工具，可用于针对特定通路、疾病、细胞对药物治疗的反应、发育过程、基因调控等编码或非编码区域的大规模或全基因组功能筛选。表3展示了常用的CRISPR筛选方法并进行了比较。
表3 CRISPR筛选方法比较
| 筛选策略 | 机制 | 靶向区域 | 应用 |
|---|---|---|---|
| CRISPR KO | 野生型Cas9或Cas9核酸内切酶切割DNA。当细胞试图修复DNA断裂时，会在靶位点引入随机突变。 | 主要为编码区域 | 主要用于编码基因的功能筛选 |
| CRISPRa | 酶切活性失活的突变型Cas9（dCas9）融合转录激活因子（VP64），结合靶位点调控激活基因表达。 | 通常为启动子区域或者其它非编码调控区域 | 编码基因的功能获得型筛选、非编码区域的调控功能筛选 |
| CRISPRi | 酶切活性失活的突变型Cas9（dCas9）融合转录抑制因子（KRAB），结合靶位点调控抑制基因表达。 | 通常为启动子区域或者其它非编码调控区域 | 编码基因的功能缺失型筛选、非编码区域的调控功能筛选 |
图1 云舟生物CRISPR文库的复杂度、覆盖率和序列比对的一致性。来自于云舟生物构建的CRISPR文库的数据以无偏好方式进行收集和分析。（A）文库复杂度范围从102到>105。（B）gRNA的覆盖率和读取的比对率均很高，表明我们的文库具有出色的覆盖率和低错误率。
图2 包含7.7×104个gRNA的文库的gRNA分布统计。gRNA read counts使用NGS库大小（一千万reads）进行标准化，并以log2尺度绘制。NGS测序深度为300×。
如果您需要使用您的文库质粒构建文库，请按照外来物品接收指南将质粒寄送给我们。请严格按照我们的指南来进行装运以免造成物品的任何延误和损坏。客户提供的所有材料均需经过QC检测，每一份材料附加检测费用。请注意，客户提供物品接收并通过QC之后生产才正式开始。对于使用客户文库质粒构建的文库，我们无法保证文库的多样性和均一性。
对于CRISPR介导的基因编辑，Cas9核酸酶通过特异性的gRNA作用至靶位点以产生DNA切割。在大多数情况下，为了实现简单的基因敲除，可以将单个gRNA与Cas9共同使用以产生DSB，然后通过NHEJ进行低效率的DNA修复，从而导致序列发生永久性突变，比如产生基因的小片段插入或碱基缺失。这类突变的一部分会导致基因的阅读框移码、出现提前终止密码子等，最终导致目的基因的功能丧失。
双gRNA则一般用于结合Cas9(D10A)切口酶对靶位点的两条反向DNA链进行切割。在这种方法中，切口酶将在两条链上产生单链切割，每一条链上的切割位点通过两条gRNA中的一条引导，然后在靶位点产生DSB。一般来说，这种方法减少潜在的脱靶效应，因为该种DSB的产生要求两条gRNA同时靶向序列。
当使用Cas9(D10A)切口酶和外源供体 DNA 模板将特定的碱基（例如敲入）引入感兴趣的基因时，也可以使用双gRNA。在这种方法中，两条反向的DNA链将被两个gRNA靶向位于所需突变位点两侧的两个位点，然后通过HDR途径利用外源DNA供体模板来修复切除的序列。
对于典型的基因敲除筛选，CRISPR文库可以使用两种骨架进行构建，分别是单载体系统和双载体系统。在单载体系统中，Cas9或Cas9变体与gRNA共表达，即两者在同一骨架上；而在双载体系统中，Cas9或Cas9变体和gRNA分别在不同的载体上表达；或是表达gRNA的载体导入稳定表达Cas9的细胞系中。单载体系统的优点是不需要两种载体共转染或转导到细胞，而且可以在非Cas9稳定表达的细胞系使用。但是，它的克隆效率和病毒包装效率比双载体系统低，通用性也较差。
我们使用的gRNA设计和评分使用了CRISPR文库设计（CLD）中的规则 。简而言之，对于每个物种，我们找出符合N(20)NGG规则的靶序列，把错配碱基≤3的序列列为潜在的脱靶位点，计算出每个gRNA的脱靶分值，进而得出最终的gRNA特异性分值。gRNA特异性分值在0-100之间，分值越大靶向特异性越高。
请注意特异性分值只是一个参考值。实际的靶向效率和特异性可能会与预测的分值有偏差，低分值的gRNA也可能有较好的靶向效果。
服务商工作站 >>
