CRISPR/Cas9系统是当今炙手可热的基因编辑工具，可以通过NHEJ途径敲除目的基因，或通过同源重组敲除、敲入或标记基因。此外，Cas9经过改造成为没有剪切活性的Cas9（dead Cas9， dCas9）后，还可以充当基因表达的可编程阻遏物，从而用于构建CRISPRi基因抑制表达系统。对于CRISPR基因编辑应用，我们提供传统和非整合型两种CRISPR慢病毒。对于CRISPRi基因抑制应用，我们提供的CRISPRi慢病毒套装包含2种病毒：gRNA慢病毒和dCas9-KRAB-MeCP2慢病毒。
CRISPR（3+1）慢病毒套装（整合/非整合慢病毒）
| 服务名称 | 生产规格 | 交付内容 | 套装价格（CNY） | 周期 |
|---|---|---|---|---|
| CRISPR（3+1）慢病毒套装制备 | 小规格 |
| ￥7,680.00 | 11-22天 |
| 中规格 |
| ￥10,080.00 | ||
| 大规格 |
| ￥15,980.00 | ||
| 超纯化中规格 |
| ￥19,580.00 | ||
| 超纯化大规格 |
| ￥23,380.00 |
注意：以上价格和周期包含载体构建
CRISPRi（3+1）慢病毒套装
| 服务名称 | 生产规格 | 交付内容 | 套装价格（CNY） | 周期 |
|---|---|---|---|---|
| CRISPRi（3+1）慢病毒套装制备 | 小规格 |
| ￥7,680.00 | 11-22天 |
| 中规格 |
| ￥10,080.00 | ||
| 大规格 |
| ￥15,980.00 | ||
| 超纯化中规格 |
| ￥19,580.00 | ||
| 超纯化大规格 |
| ￥23,380.00 |
注意：以上价格和周期包含载体构建
当前我们提供慢病毒类型的CRISPR（3+1）和CRISPRi（3+1）套装。这些CRISPR载体系统均经过我们专门优化，在大肠杆菌中具有高拷贝复制、可包装产生高滴度病毒并且对于靶细胞具有可靠的转导效率。
我们的CRISPR慢病毒载体能将CRISPR/Cas9系统整合进细胞基因组中，随细胞分裂而分裂，实现Cas9和gRNA的长期稳定表达。如果选择非整合型慢病毒进行包装，这种慢病毒转导细胞后由于其突变的整合酶没有功能，病毒DNA不插入细胞基因组并且以非复制型游离体存在于转导细胞中，则转导进细胞的Cas9和gRNA不能持续表达，有助于降低脱靶风险。
在CRISPRi系统中，dCas9是与KRAB和MeCP2阻遏域融合在一起的，具有强大的基因阻遏功能。与shRNA相比，CRISPRi系统可以沉默更多类型基因，如蛋白编码基因、非编码RNA、microRNA等。对于我们的CRISPRi慢病毒套装，其gRNA慢病毒携带Puromycin抗性基因，而dCas9-KRAB-MeCP2慢病毒携带Hygromycin抗性基因。进行实验时，使用Puromycin和Hygromycin两种抗生素筛选转导细胞。
暂无
为了测定慢病毒的滴度，我们使用系列稀释的慢病毒转导293T细胞，然后使用qPCR的方法来定量测定每个宿主细胞基因组（使用BMP2拷贝数作为内参）中病毒基因组（使用WPRE拷贝数作为参照）整合的平均拷贝数。这种方法能够测定病毒的功能滴度，精确地反映出具有感染能力的病毒颗粒的数量。另外，还有其他测定病毒滴度的方法，其中一种是对病毒基因组RNA直接进行RT-qPCR来测定，但这种方法会严重高估病毒的滴度（通常约10倍，有时高达100倍），因为它测量的是所有病毒的基因组，包括无活性的病毒颗粒。由于慢病毒本身的不稳定性，如果病毒不储存于-80℃或被反复冻融，都会使得无活性病毒颗粒增加。另一种方法是基于病毒载体上携带的荧光或药物筛选标记的表达量来测定转导细胞的数量。该方法可能会严重低估病毒滴度，因为荧光或药物筛选标记可能由于沉默或其他原因未能在一些宿主细胞中被检测到，而有的细胞可能会被多个病毒颗粒感染。
对于CRISPR介导的基因组编辑，Cas9核酸酶靶向位点特异性引导RNA（gRNA）的靶位点以产生DNA切割。在大多数情况下，为了产生简单的基因敲除，可以将单个gRNA与Cas9一起使用以产生双链断裂（DSB），并通过非同源末端连接（NHEJ）低效修复，导致永久突变 ，如在修复位点产生小插入或缺失。某些突变会产生移码，终止密码子提前出现等，从而导致目的基因功能缺失。如果基因组中两个临近的位点（如小于几kb）同时作为靶向位点，使用双gRNA可能会导致中间区域片段的缺失（即片段敲除）。
如果使用Cas9_D10A缺刻酶靶向单个靶位点的两条相对链，则可以使用双gRNA。缺刻酶将在两条链上产生单链切割，两条gRNA分别引导缺刻酶在对应的一条链上进行切割，从而引起靶位点处发生DSB。 通常情况下，这种方法可以减少CRISPR/Cas9的脱靶效应，因为需要两个gRNA同时打靶才能产生DSB。
当使用Cas9_D10A缺刻酶和外源Donor DNA模板将特定碱基（例如敲入）引入目的基因时，也可以使用双gRNA。两个gRNA靶向位于所需突变位点侧翼的两条相对链，然后通过同源定向修复（HDR）的方法利用外源模板来修复被切除的序列。
| shRNA | CRISPRi | |
|---|---|---|
| 工作原理 | 基因敲除能通过short hairpin RNAs（shRNAs）实现。shRNA表达后，被加⼯成small interfering RNAs（siRNAs）。这些siRNA被运到RNA-induced silencing complex（RISC）那里。接着，siRNA的反向链与正向链解开，正向链被降解、丢弃，反向链继续与RISC复合物结合，将有活性的RISC复合物引导⾄与反向链互补的mRNA。⼀旦反向链与mRNA完全互补结合，RISC复合物中的⼀个蛋白，argonaute，会剪切mRNA，从而抑制mRNA编码的蛋⽩翻译表达。 | CRISPR interference（CRISPRi）技术采⽤了⼀个nuclease-dead Cas9蛋白（dCas9）与转录抑制因⼦组成的融合蛋白，例如Kruppel-associated box（KRAB）转录抑制因子。在这个融合蛋白里，dCas9仍然保留与DNA结合的活性，但是失去了核酸酶活性。dCas9融合蛋⽩在⼀条guide RNA（gRNA）引导下，结合至目标基因的transcriptional start site（TSS）区域，从而阻遏该基因的转录。 |
| 目标分子 | 成熟mRNA | 基因的TSS区域 |
| 打靶事件发⽣位置 | 细胞质 | 细胞核 |
| 抑制基因种类 | mRNA编码基因、胞质lncRNA | mRNA编码基因（针对因转录本太短而不能设计出有效shRNA的基因，可选择CRISPRi技术）、胞质lncRNA、核内lncRNA |
| 脱靶⻛险 | RNAi存在2类脱靶：序列相关性和非序列相关性序列相关性脱靶：仅凭有限的部分碱基互补，siRNA就能引起非目标mRNA的沉默。取决于siRNA序列，⼀个siRNA可能抑制成百上千条转录本。非序列相关性脱靶：shRNA采⽤内源miRNA通路实现基因敲除。当⼤量shRNA导⼊细胞后，它们使RNAi系统达到饱和，并与内源miRNA竞争蛋白，例如Dicer、RISC和其它因子。由此，那些内源miRNA介导的基因调控受到干扰，导致不可以预期的脱靶。 | 与shRNA相比，CRISPRi的脱靶机率超低。 |
| 可逆的基因抑制 | 如使⽤质粒载体或者合成的siRNA，基因沉默是可逆的。如使⽤整合型病毒载体（如：慢病毒载体）实现结构性表达shRNA，则沉默非可逆性。 | 如使⽤质粒载体或者合成的dCas9融合蛋白/gRNA，基因沉默是可逆的。如使⽤整合型病毒载体（如：慢病毒载体）实现结构性表达dCas9融合蛋白和gRNA，则沉默非可逆性。如沉默重要的基因，推荐使⽤TetOn诱导表达CRISPRi慢病毒载体，可通过药物控制这些基因的沉默。 |
我们使用的gRNA设计和评分规则与张峰实验室开发的运算规则类似。简而言之，对于每个物种，我们找出符合N(20)NGG规则的靶序列，把错配碱基 ≤3的序列列为潜在的脱靶位点，计算出每个gRNA的脱靶分值，进而得出最终的gRNA特异性分值。gRNA特异性分值在0-100之间，分值越大靶向特异性越高。
请注意特异性分值只是一个参考值。实际的靶向效率和特异性可能会与预测的分值有偏差，低分值的gRNA也可能有较好的靶向效果。
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