Dual-gRNA慢病毒文库

我们提供的Dual-gRNA慢病毒文库，是用于人或者小鼠细胞的全基因组敲除筛选实验。每个慢病毒载体含有一对gRNA表达盒子，这对gRNA打靶同一个基因。导入Cas9蛋白表达细胞后，每个载体能够在一个基因上产生两个切口。细胞修复这两个切口的时候，往往倾向发生两个切口之间的大片段缺失。这两个切口通常被设计在目的基因的重要区域上，当两个切口之间的片段缺失后，目的基因的功能也会丧失。

Dual-gRNA文库要比Single-gRNA文库强大的多，这是由于Dual-gRNA文库引入的大片段缺失在产生基因功能缺失上更高效。人类和小鼠的Dual-gRNA文库被制备成即用型的慢病毒文库，分别靶向20,048个人类基因和20,493个小鼠基因，每个基因被4-6对不同的gRNA打靶，这些gRNA分布在多个载体。这些文库是高效、实惠的基因组范围功能丧失筛选实验工具。

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图1所示为使用Dual-gRNA慢病毒文库进行基因筛选的工作流程。首先，用慢病毒文库转导表达Cas9的目的细胞，通过慢病毒载体上携带的标记基因筛选阳性转导细胞（如药筛基因或者荧光标记基因）。接着，将阳性转导细胞分成两群细胞：对照组和实验组。然后，对实验组细胞进行特定选择压力实验（如药物处理或者重复传代）来筛选出具有理想表型的细胞。在这个环节，通常有三种常用的筛选策略：1）细胞活性筛选：筛选出在选择压力下gRNA富集或者丢失的存活细胞；2）报告基因表达筛选：筛选出报告基因表达变强或变低同时gRNA富集或者丢失的细胞（如，gRNA打靶调控报告基因的转录因子）; 3）细胞行为筛选：筛选出与细胞入侵、迁移等行为基因相关gRNA。筛选后，收集实验组和对照组细胞，使用Sanger测序或者二代测序（NGS）鉴定出在实验组（相对于对照组）中变多了或者变少了的gRNA。最后，可通过下游功能实验进一步探究那些理论上被富集或者丢失的gRNA打靶的基因。

图1. 采用Dual-gRNA慢病毒文库实现基因敲除筛选的工作流程。引用来源： Acta Biochim Biophys Sin 44:103-112 (2012)

亮点

独特的Dual-gRNA设计：文库中每个慢病毒载体包含两个gRNA表达盒子和一个EGFP/puromycin双标记基因表达盒子（图2）。载体一经导入细胞，同一载体上两个gRNA同时表达，靶向同一基因的两个不同位点，产生两个DNA切口，随后造成基因功能缺失。每个载体上的两个gRNA由两个不同的U6启动子（人U6启动子和猴U6启动子）以及两个不同的gRNA scaffold（见于Nat Methods. 14:573 (2017)）组成。gRNA scaffold序列不同，但功能相当。这样的独特设计，降低了两个gRNA表达盒子序列之间的同源重组几率，同时利于从转导文库的细胞中进行PCR扩增以及通过NGS对上游gRNA、下游gRNA或者两个gRNA进行测序。

图2.Dual-gRNA慢病毒载体图谱

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全基因组/高覆盖率打靶： 人类和小鼠Dual-gRNA慢病毒文库分别打靶20,048个人类基因和20,493个小鼠基因，平均每个基因被4-6对不同的gRNA打靶，这些gRNA是通过一系列参数筛选设计出来的，包括：1）计算脱靶得分，将脱靶风险大大降低； 2）计算切口位点位置，确保两个位点之间的片段缺失能造成基因功能缺失；3）计算切口之间的距离，确保突变倾向于形成跨越切口的大片段缺失，而不是每个切口的局部突变；4）计算每个基因中被影响的转录本数目，确保所有转录都尽可能敲除。所有的gRNA可切割位点均位于外显子内。因此，即使不能产生大片段缺失，单个位点的局部突变（通常为几个到几十个碱基缺失/插入）同样能破坏基因功能。

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NGS验证文库质量：采用NGS验证Dual-gRNA慢病毒文库的每一个载体的gRNA序列。鉴定结果显示，NGS测序读数与理论的人类Dual-gRNA文库、小鼠Dual-gRNA文库的匹配率分别是>87%和75%。此外，人类Dual-gRNA文库中，>99%的理论gRNA序列被NGS检测到。在小鼠Dual-gRNA文库中，>97%的理论gRNA序列被NGS检测到。因此，这两个文库的gRNA均具有很高的覆盖率和很低的错误率。据我们所知，这是目前所报道的质量最高的双gRNA文库。

高度均一性：两个文库的gRNA均表现出高度的均一性（图3）。

图3. 两个文库的gRNA分布。gRNA read counts are normalized by NGS library size (10 million reads) and plotted in log2 scale.

完善的慢病毒载体和即用的高滴度慢病毒：Dual-gRNA文库采用第三代慢病毒载体表达，该系统能在多种细胞中高效表达。由于能将gRNA文库高效地、永久性地、均一地导入细胞，该慢病毒载体系统是体外筛选的理想工具。Dual-gRNA文库以即用型慢病毒形式提供，病毒滴度高（>10⁸ TU/ml），节省了病毒包装和滴度测定的时间。该慢病毒载体是自我复制缺陷型，更具很高的生物安全性。

高效筛选/追踪阳性转导细胞的双标记基因：慢病毒载体含有表达EGFP荧光报告基因和puromycin抗性基因（Puro）的基因表达盒子，允许添加puromycin抗生素和使用绿色荧光来筛选/追踪阳性转导细胞（图4）。

图4. 人类全基因组Dual-gRNA慢病毒文库（MOI=10）转导293T细胞后，接着Puromycin筛选（1.5 ug/ml）4天后的EGFP表达情况。左：明视野；右：绿色荧光视野。

订购信息

产品名称	靶基因数量	gRNA对数量	规格*	货号	价格（CNY）
人类全基因组Dual-gRNA慢病毒文库	20,048	91,926	中规格 (>1.0x10⁸ TU/ml, 1 ml)	LVM(Lib190505-1046fgb)	￥30,800 ￥61,600
人类全基因组Dual-gRNA慢病毒文库	20,048	91,926	5x中规格 (>1.0x10⁸ TU/ml, 5 ml)	LV5M(Lib190505-1046fgb)	￥65,450 ￥13,0900
小鼠全基因组Dual-gRNA慢病毒文库	20,493	90,344	中规格 (>1.0x10⁸ TU/ml, 1 ml)	LVM(Lib190505-1050kpm)	￥30,800 ￥61,600
小鼠全基因组Dual-gRNA慢病毒文库	20,493	90,344	5x中规格 (>1.0x10⁸ TU/ml, 5 ml)	LV5M(Lib190505-1050kpm)	￥65,450 ￥13,0900

* 中规格的病毒量足够在100x fold coverage下进行＞5次筛选； 5x中规格的病毒量足够在100x fold coverage下进行＞25次筛选。

逆卷积（Deconvolution）服务

不清楚如何使用NGS鉴定筛选实验后的gRNA打靶情况？您可将样本的基因组DNA发送给我们，我们会制备NGS文库，高通量测序并进行数据分析，只需几周即可将每个样本的gRNA计算发送给您。如需该服务，请点击“ 请问载体君 ”将需求发送给我们。