Dual-gRNA慢病毒文库
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Dual-gRNA慢病毒文库

我们提供的Dual-gRNA慢病毒文库,是用于人或者小鼠细胞的全基因组敲除筛选实验。每个慢病毒载体含有一对gRNA表达盒子,这对gRNA打靶同一个基因。导入Cas9蛋白表达细胞后,每个载体能够在一个基因上产生两个切口。细胞修复这两个切口的时候,往往倾向发生两个切口之间的大片段缺失。这两个切口通常被设计在目的基因的重要区域上,当两个切口之间的片段缺失后,目的基因的功能也会丧失。
Dual-gRNA文库要比Single-gRNA文库强大的多,这是由于Dual-gRNA文库引入的大片段缺失在产生基因功能缺失上更高效。人类和小鼠的Dual-gRNA文库被制备成即用型的慢病毒文库,分别靶向20,048个人类基因和20,493个小鼠基因,每个基因被4-6对不同的gRNA打靶,这些gRNA分布在多个载体。这些文库是高效、实惠的基因组范围功能丧失筛选实验工具。
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图1所示为使用Dual-gRNA慢病毒文库进行基因筛选的工作流程。首先,用慢病毒文库转导表达Cas9的目的细胞,通过慢病毒载体上携带的标记基因筛选阳性转导细胞(如药筛基因或者荧光标记基因)。接着,将阳性转导细胞分成两群细胞:对照组和实验组。然后,对实验组细胞进行特定选择压力实验(如药物处理或者重复传代)来筛选出具有理想表型的细胞。在这个环节,通常有三种常用的筛选策略:1)细胞活性筛选:筛选出在选择压力下gRNA富集或者丢失的存活细胞;2)报告基因表达筛选:筛选出报告基因表达变强或变低同时gRNA富集或者丢失的细胞(如,gRNA打靶调控报告基因的转录因子); 3)细胞行为筛选:筛选出与细胞入侵、迁移等行为基因相关gRNA。筛选后,收集实验组和对照组细胞,使用Sanger测序或者二代测序(NGS)鉴定出在实验组(相对于对照组)中变多了或者变少了的gRNA。最后,可通过下游功能实验进一步探究那些理论上被富集或者丢失的gRNA打靶的基因。
图1. 采用Dual-gRNA慢病毒文库实现基因敲除筛选的工作流程。 引用来源: Acta Biochim Biophys Sin 44:103-112 (2012)
亮点
独特的Dual-gRNA设计:文库中每个慢病毒载体包含两个gRNA表达盒子和一个EGFP/puromycin双标记基因表达盒子(图2)。载体一经导入细胞,同一载体上两个gRNA同时表达,靶向同一基因的两个不同位点,产生两个DNA切口,随后造成基因功能缺失。每个载体上的两个gRNA由两个不同的U6启动子(人U6启动子和猴U6启动子)以及两个不同的gRNA scaffold(见于Nat Methods. 14:573 (2017))组成。gRNA scaffold序列不同,但功能相当。这样的独特设计,降低了两个gRNA表达盒子序列之间的同源重组几率,同时利于从转导文库的细胞中进行PCR扩增以及通过NGS对上游gRNA、下游gRNA或者两个gRNA进行测序。
图2.Dual-gRNA慢病毒载体图谱

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全基因组/高覆盖率打靶: 人类和小鼠Dual-gRNA慢病毒文库分别打靶20,048个人类基因和20,493个小鼠基因,平均每个基因被4-6对不同的gRNA打靶,这些gRNA是通过一系列参数筛选设计出来的,包括:1)计算脱靶得分,将脱靶风险大大降低; 2)计算切口位点位置,确保两个位点之间的片段缺失能造成基因功能缺失;3)计算切口之间的距离,确保突变倾向于形成跨越切口的大片段缺失,而不是每个切口的局部突变;4)计算每个基因中被影响的转录本数目,确保所有转录都尽可能敲除。所有的gRNA可切割位点均位于外显子内。因此,即使不能产生大片段缺失,单个位点的局部突变(通常为几个到几十个碱基缺失/插入)同样能破坏基因功能。
下载人类全基因组Dual-gRNA文库的靶基因和gRNA列表 >>
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NGS验证文库质量:采用NGS验证Dual-gRNA慢病毒文库的每一个载体的gRNA序列。鉴定结果显示,NGS测序读数与理论的人类Dual-gRNA文库、小鼠Dual-gRNA文库的匹配率分别是>87%和75%。此外,人类Dual-gRNA文库中,>99%的理论gRNA序列被NGS检测到。在小鼠Dual-gRNA文库中,>97%的理论gRNA序列被NGS检测到。因此,这两个文库的gRNA均具有很高的覆盖率和很低的错误率。据我们所知,这是目前所报道的质量最高的双gRNA文库。

高度均一性:两个文库的gRNA均表现出高度的均一性(图3)。
图3. 两个文库的gRNA分布。gRNA read counts are normalized by NGS library size (10 million reads) and plotted in log2 scale.

完善的慢病毒载体和即用的高滴度慢病毒:Dual-gRNA文库采用第三代慢病毒载体表达,该系统能在多种细胞中高效表达。由于能将gRNA文库高效地、永久性地、均一地导入细胞,该慢病毒载体系统是体外筛选的理想工具。Dual-gRNA文库以即用型慢病毒形式提供,病毒滴度高(>108 TU/ml),节省了病毒包装和滴度测定的时间。该慢病毒载体是自我复制缺陷型,更具很高的生物安全性。

高效筛选/追踪阳性转导细胞的双标记基因:慢病毒载体含有表达EGFP荧光报告基因和puromycin抗性基因(Puro)的基因表达盒子,允许添加puromycin抗生素和使用绿色荧光来筛选/追踪阳性转导细胞(图4)。
图4. 人类全基因组Dual-gRNA慢病毒文库(MOI=10)转导293T细胞后,接着Puromycin筛选(1.5 ug/ml)4天后的EGFP表达情况。左:明视野;右:绿色荧光视野。
订购信息
产品名称 靶基因数量 gRNA对数量 规格* 货号 价格(CNY)
人类全基因组Dual-gRNA慢病毒文库 20,048 91,926

中规格

(>1.0x 108 TU/ml, 1 ml)

LVM(Lib190505-1046fgb) ¥6,1600

5x中规格

(>1.0x 108 TU/ml, 5 ml)

LV5M(Lib190505-1046fgb) ¥13,0900
小鼠全基因组Dual-gRNA慢病毒文库 20,493 90,344

中规格

(>1.0x 108 TU/ml, 1 ml)

LVM(Lib190505-1050kpm) ¥6,1600

5x中规格

(>1.0x 108 TU/ml, 5 ml)

LV5M(Lib190505-1050kpm) ¥13,0900

* 中规格的病毒量足够在100x fold coverage下进行>5次筛选; 5x中规格的病毒量足够在100x fold coverage下进行>25次筛选。

逆卷积(Deconvolution)服务
不清楚如何使用NGS鉴定筛选实验后的gRNA打靶情况?您可将样本的基因组DNA发送给我们,我们会制备NGS文库,高通量测序并进行数据分析,只需几周即可将每个样本的gRNA计算发送给您。 如需该服务,请点击“ 请问载体君 ”将需求发送给我们。