细菌基因组编辑

细菌基因组编辑可实现对细菌生理或代谢特性的精确修饰与调控。从自定义基因组编辑策略到交付经过序列确认的菌株，云舟生物可提供全方位的细菌基因组编辑解决方案。我们具备在基因敲除、插入以及靶向突变等多种项目的专业知识，可确保根据您的具体需求实现高效的细菌基因组编辑。

服务详情

Typical workflow of genome engineering in bacteria

图1. 细菌基因组编辑的典型流程

服务模块	简述	价格（CNY）	周期
载体设计与克隆	云舟生物富有经验的科学家团队将为您优化载体设计，将关键元件克隆至恰当的质粒骨架。	￥3,380起	2-3周
菌株评估	对目标菌株进行一系列关键参数评估，包括生长条件、转化效率、序列验证以及与基因组编辑相关的其它因素。	免费	1周
编辑菌株制备*	将质粒导入目标菌株细胞，随后在特定条件下培养以促进基因组编辑。含有所需修饰的细胞将进一步进行筛选和验证以确认编辑效果。	￥20,000起	2-5周

*我们默认以甘油菌形式交付基因编辑后的菌株。我们的标准质量控制（QC）包含PCR和Sanger测序项目。点此可咨询额外的QC项目。

技术详情

λ Red重组

λ Red重组系统是一种在细菌基因组编辑广泛使用的工具。这一源自λ噬菌体的系统可显著增强外源DNA片段与宿主基因组之间的同源重组效率。该系统由三个主要部分组成，它们协同作用促进同源重组的发生（图2）。

Key components of the Lambda Red recombineering system

图2 λ Red重组系统的关键组分。Exo，一种5'至3’核酸外切酶，可切割双链DNA（dsDNA）；Beta，一种单链DNA（ssDNA）结合蛋白，促进外源DNA片段与靶位点同源序列的退火配对；Gam，抑制宿主细胞的核酸酶，可阻止导入细菌细胞的外源DNA被降解。

λ Red基因通常在引入供体DNA之前就需要在细菌细胞中表达。一种表达方法是使用编码该组分的质粒，或者使用常用于基因组编辑的稳定整合了λ Red基因的细菌菌株。含有遗传修饰的供体DNA可以以线性双链DNA（dsDNA）或单链DNA（ssDNA）的形式导入细菌细胞，而该供体序列模板通常含有筛选标记（如抗生素抗性基因）。Red蛋白（Exo、Beta和Gam）能促进供体DNA与靶序列之间的同源重组。重组完成后，一般采用药筛结合菌落PCR的方法分离获得成功编辑的细菌细胞。

CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9是一种广泛应用于各类生物（包括细菌）的基因组编辑工具。在许多细菌物种（如大肠杆菌）中，由于非同源末端连接（NHEJ）修复途径的效率低下，CRISPR诱导的双链断裂（DSB）将具有致死性。这一特性使CRISPR无需额外筛选标记即可实现强效的反向筛选。

基于CRISPR系统的细菌基因组编辑的所需组分一般包含Cas9蛋白、向导RNA（gRNA）以及供体DNA。为提高编辑效率，通常会共表达重组酶（如λ-Red系统的组分）以促进同源重组的发生。

CRISPR组件的基因递送可通过多种策略实现。图3展示了这样一种方案：Cas9与λ Red重组系统的蛋白使用单个质粒共表达，而gRNA使用第二个质粒表达。

Schematic representation of gene replacement utilizing the CRISPR-Cas9 system

图3 利用CRISPR基因编辑在细菌中创建点突变的模式图。编码Cas9和重组酶的质粒首先被导入细菌细胞，然后诱导λ Red蛋白的表达。随后将表达gRNA的质粒以及供体DNA导入表达有Cas9和重组酶的细胞。如果同源重组失败，则由Cas9引发的DSB将导致细胞死亡（右）。相对地，只有当细胞发生了供体DNA和基因组靶序列之间的同源重组时，细胞才能存活，从而实现所需的基因修饰（左）。

自杀质粒

自杀质粒携带了包含所需编辑的同源序列，并被设计为仅在允许宿主中或在特定条件下才能复制。该特性一般可通过以下机制实现：使用反向筛选标记（比如赋予蔗糖敏感性的sacB基因）以及使用条件性复制系统（比如温度敏感型复制起点）。在允许条件下将质粒导入目标细菌后，整个质粒通过单次同源重组事件即可整合至宿主基因组。当环境转换为非允许条件时，未整合的质粒因无法复制而丢失（图4）。随后发生的第二次同源重组事件将质粒的骨架序列从基因组中去除，而此时可通过PCR筛选获得携带所需编辑的细胞。尽管该技术原理简单，但自杀质粒需要较长的同源臂，且存在较高假阳性风险，因此通常需要进行多轮筛选。

Schematic representation of gene knockin using suicide plasmids with a temperature-sensitive origin of replication

图4 使用包含温度敏感型复制起点的自杀质粒进行基因敲入的模式图。目的基因（GOI）以及筛选标记通过同源重组整合至基因组靶位点。通过抗生素筛选出的克隆进一步在非允许温度下培养，避免质粒复制。第二次重组事件发生将产生包含稳定整合或者基因组回退至野生型的两种克隆。对发生了敲入的克隆进一步筛选并使用PCR确认基因敲入。

案例研究

CRISPR-Cas9 mediated gene editing in E. coli

图5 CRISPR/Cas9介导的E. coli基因组编辑。（A）通过诱导表达λ Red蛋白以及同时使用CRISPR/Cas9系统敲除E. coli的基因组片段。（B）在未经编辑的细胞中（泳道1），对靶区域PCR扩增获得了符合预期的约3900 bp大小的扩增子，而对于经过CRISPR基因敲除的细胞（泳道2），其扩增子大小只有约1800 bp，表明约有2100 bp的片段被敲除了。

客户提供材料

如需客户提供材料，请联系我们了解外来物品接收指南。请严格按照我们的指南来进行装运以免造成物品的任何延误和损坏。客户提供的所有材料均需经过QC检测，每一份材料附加检测费用。请注意，客户提供物品接收并通过QC之后生产才正式开始。

常见问题解答

不同的细菌基因组编辑方法之间有何优劣比较？▼

每种方法都有其优缺点，具体总结如下。通常需要结合多种方法，才能实现理想的编辑效果。其中，基于CRISPR的技术具有高效性和灵活性，因此编辑效果尤为显著。

方法	描述	优势	不足
CRISPR/Cas9	在供体DNA存在的情况下，gRNA引导的Cas9诱导DNA双链断裂，通过同源重组修复机制实现目标编辑。	反向筛选方式：未经编辑的细胞会被DSB诱导细胞死亡同时适用于大范围和小范围的基因组编辑	潜在的脱靶效应需要PAM位点
λ Red重组	源自λ噬菌体，利用Exo、Beta和Gam蛋白实现高重组效率。	对多种编辑类型十分有效只需要很短的同源序列区域（40-50 bp）用于同源重组	可能需要专门的菌株用于控制重组酶的表达可能需要使用反向筛选的方式去除抗生素筛选标记
自杀质粒	质粒被设计为在一种宿主/条件下复制，而在另一种宿主/条件下不复制。	不需要特定的菌株对于基因组序列的大规模删除或者对靶基因功能的破坏十分有效	不太高效的编辑效率假阳性频率高需要较长的同源臂