载体指南

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## 概述我们的睡美人（Sleeping beauty）转座子载体系统可以高效地将外源DNA插入宿主细胞基因组。该系统在技术上十分简洁，仅需要进行质粒转染（无需病毒转导）即可永久性地对宿主细胞基因组插入您的目的基因。该载体的转座子系统来源于Tc1/mariner转座子超家族，一开始是从鱼类基因组分离出来，并且经过了大量的累积突变已失去转座子活性。睡美人转座子通过移除鲑鱼基因组的Tc1/mariner转座子上的这些失活突变，重新构筑出有活性的转座子。该方法合成的转座子提供了一种在脊椎动物中高效地进行基因转导和插入突变的方法。睡美人转座子载体系统包含两个组分。一个组分是Sleeping beauty转座酶（通常为表达Sleeping beauty转座酶的IVT mRNA）。另一个组分则是转座子载体，包含由两个反向/正向重复序列（IR/DR）包围的转座子区域。需要被递送至宿主细胞的基因被克隆至该区域。...

Probe-RNA体外转录载体（用于原位杂交）

## 概述我们的体外转录载体是简单有效的RNA转录系统，适用于各种研究。长RNA体外转录载体可用于产生RNA探针（即核糖核酸探针），用于原位杂交。该系统结合了T7和SP6启动子，您的目的序列将被克隆在这两个启动子之间。在适当的反应条件和三磷酸核苷酸的存在下，T7噬菌体RNA聚合酶（T7 RNAP）或SP6 RNAP可以促进高效合成核糖核酸探针。这两个启动子方向相反，一个启动子将产生有义转录物，另一个将产生反义转录物。根据插入片段的方向和实验目的，用户可以选择使用T7 RNAP、SP6 RNAP或两者一起进行体外转录。T7和SP6启动子侧翼序列也可用作PCR扩增或测序的引物结合位点。通过利用半抗原标记的或荧光基团标记的或是放射性标记的核苷酸进行转录，以便于原位杂交探针定位检测。我们建议您参考已发表文献中经测试的体外转录和原位杂交步骤说明来进行实验。 T7和SP6 RNAP对于有效的转录起始均具有碱基要求，且这些碱基已经被放置到载体上。T7启动子3'末端的前两个碱基是GG，紧接着是客户的目的序列；SP6启动子3'末端的前三个碱基是GAA，紧接着是客户的目的序列。...

AAV基因诱导表达载体（Tet-On）

## 概述 AAV诱导型基因表达载体结合了载体家应用广泛的AAV载体系统和Tet-On基因诱导表达系统，帮助您在体内体外都能进行四环素诱导表达实验。 Tet-On基因诱导表达载体系统是在哺乳动物细胞中进行实时GOI表达的强大工具。我们的Tet- On基因诱导表达载体系统在无四环素及其类似物（多西环素）的情况下可以做到GOI几近完全沉默并且在加入四环素及其类似物（多西环素）的情况下快速响应实现GOI表达。这是通过tTS和rtTA蛋白响应四环素及其类似物（多西环素）的基因调控功能实现的。当不存在四环素及其类似物（如doxycycline）的情况下，目的基因几乎或完全沉默；当往体系中添加四环素或其他类似物（如doxycycline）时，目的基因得到快速高水平表达。四环素不存在的情况下时，衍生于TeR（Tet抑制蛋白）和KRAB- AB（Kid-1蛋白转录抑制结构域）的融合蛋白tTS结合TRE启动子，导致基因转录抑制。另一方面，四环素存在时，衍生于突变型Ter抑制蛋白和VP16蛋白（转录激活结构域）的融合蛋白rtTA结合TRE启动子，激活基因转录。...

MSCV逆转录病毒基因表达载体

## 概述 MSCV（Murine stem cell virus，鼠干细胞病毒）逆转录病毒载体系统是一种非常高效的、能在胚胎干细胞（ES）、胚胎癌细胞（EC）、造血干细胞（HS）及其他哺乳动物细胞系中大量表达目的基因的病毒工具。 MSCV逆转录病毒载体衍生于MESV和LN两种逆转录病毒载体，这两种载体分别是基于鼠PCC4细胞骨髓增生性肉瘤病毒（PCMV）和莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）。MSCV包含一个延伸的杂合包装信号，该信号源于LN载体，同传统的逆转录病毒载体相比，病毒滴度更高。此外，MSCV逆转录病毒载体包含PCMV病毒来源的经过设计的5'LTR，有助于靶基因在ES细胞、EC细胞等多能细胞系中的转录激活，克服了目的基因在此两种细胞中抑制性表达的现象，而该现象通常能在MMLV逆转录病毒载体中观察到。 MSCV逆转录病毒载体首先构建成大肠杆菌质粒。随后同辅助质粒一起被转染到包装细胞中。在包装细胞内，位于两个长末端重复序列（LTRs）之间的载体DNA转录成RNA，辅助质粒表达病毒蛋白将RNA包装成病毒。之后，活病毒分泌到上清中，可用于直接或者浓缩后感染靶细胞。...

哺乳动物基因表达PB转座子载体

## 概述 PB转座子载体系统可以非常高效地把外源DNA插入哺乳动物细胞的基因组，该系统技术简单，可利用质粒转染（非病毒转导）把您所感兴趣的基因长期稳定地整合到靶细胞基因组。该系统来源于PB转座子，最开始在粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）中发现并分离而来。基于序列同源性分析，PB转座子是许多常见物种共有的一类转座子。 PB转座子系统包含两个组分，一个组分为PBase转座酶（通常为表达PBase的IVT mRNA）；另一个组分被称为转座子质粒，包含两个末端重复序列（TR）以及两者之间的被转座区域，需要被转座到宿主基因组中的目的基因就克隆在这个区域。当表达PBase的IVT mRNA和转座子质粒共转染靶细胞时，PBase IVT mRNA产生的转座酶将会识别转座子的两个TR元件，然后将被转座区和两个TR元件插入到宿主基因组中。转座插入通常发生在包含TTAA序列的宿主染色体位点，并在转座子两侧出现TTAA重复序列。...

哺乳动物基因普通表达腺相关病毒载体

## 概述腺相关病毒（AAV）载体系统是一种备受欢迎的体内外基因传递系统，对哺乳动物多种类型细胞具有高效的转导效率。不同于腺病毒，AAV的免疫原性极低，在体内几乎没有致病性，使得AAV成为许多动物研究的理想工具。 AAV重组载体构建完成后与辅助质粒一起转染进入包装细胞。在包装细胞中，位于两个反向重复序列（ITRs）之间的DNA片段与辅助质粒表达的病毒蛋白进一步包装成病毒颗粒。当病毒转导宿主细胞时，两个ITR之间的外源DNA及病毒基因组一起进入细胞，线性双链DNA基因组以游离DNA的形式存在于细胞核中。在大多数情况下，可以在生物安全1级（BSL1）设施中处理AAV。AAV是复制缺陷型的、不会引起炎症反应和引发人类疾病。人们已从自然界中鉴定出许多AAV病毒株，根据病毒表面衣壳蛋白的不同抗原将它们分成不同的血清型。不同血清型的病毒具有不同的组织嗜性（即感染组织特异性）。当我们的AAV载体使用不同的衣壳蛋白包装病毒时，则会赋予病毒不同的血清型。AAV包装时的ITR序列来源于AAV2，这是一种常用的AAV载体构建方式，不影响血清型。...

哺乳动物PB转座子诱导表达载体 (Tet-On)

## 概述 PB转座子诱导型基因表达载体结合了载体家高效的PB转座子载体系统和Tet- On基因诱导表达系统，帮助您在宿主基因组上永久整合可使用四环素诱导表达的GOI表达盒。 Tet-On基因诱导表达载体系统是在哺乳动物细胞中进行实时GOI表达的强大工具。我们的Tet- On基因诱导表达载体系统在无四环素及其类似物（多西环素）的情况下可以做到GOI几近完全沉默并且在加入四环素及其类似物（多西环素）的情况下快速响应实现GOI表达。这是通过tTS和rtTA蛋白响应四环素及其类似物（多西环素）的基因调控功能实现的。当不存在四环素及其类似物（多西环素）的情况下，目的基因几乎或完全沉默；当往体系中添加四环素或其他类似物（多西环素）时，目的基因得到快速高水平表达。四环素不存在的情况下时，衍生于TeR（Tet抑制蛋白）和KRAB- AB（Kid-1蛋白转录抑制结构域）的融合蛋白tTS结合TRE启动子，导致基因转录抑制。另一方面，四环素存在时，衍生于突变型Ter抑制蛋白和VP16蛋白（转录激活结构域）的融合蛋白rtTA结合TRE启动子，激活基因转录。...

哺乳动物基因表达VSV载体

## 概述水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）载体在研究病毒颗粒入侵宿主细胞、辨认介导病毒感染细胞的细胞表面受体、筛选病毒抑制药物以及疫苗开发方面有着广泛的应用。VSV病毒载体可以高效地利用异源病毒的包膜蛋白进行假型化（Presudotypted），比如那些需要在高生物安全等级实验室操作的病毒的包膜蛋白。重组VSV在宿主细胞中不能进行超过一轮的复制，因此可以在生物安全2级（BSL2）实验室进行相关操作。这些特点促使VSV病毒载体成为在无需高度隔离下研究高风险病毒侵入细胞机制的理想选择。野生型VSV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae），拥有一条单链负义RNA基因组，并且其复制依赖病毒的RNA依赖的RNA聚合酶（RNA- dependent RNA polymerase，RdRp）。VSV的单链RNA基因组编码以下五种蛋白组分：核蛋白（N）、磷酸化蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和病毒RdRp的大亚基（L）。VSV病毒颗粒中，其RNA基因组与N核蛋白组成核糖核酸蛋白（Ribonucleoprotein，RNP）。...

T-DNA双元载体（用于植物转化）

## 概述基于双元载体的农杆菌介导的遗传转化是制备转基因植物的有效方法。该系统利用细菌根瘤农杆菌杆菌将外源DNA整合到多种植物细胞基因组。农杆菌双元载体系统来源于天然肿瘤诱导（Ti）质粒，农杆菌将Ti-质粒中的转移DNA（T-DNA）区域整合到植物宿主基因组中。T-DNA位于两个25 bp的T-DNA边界重复序列之间，且两个T-DNA边界重复序列方向相同。在我们的双元载体系统中，所有与肿瘤形成相关的序列都被去除，仅留下T- DNA边界重复序列，两个T-DNA边界重复序列中间的目的序列将整合到宿主基因组中。完整的双元载体系统由两部分组成。第一种被称为T-DNA双元载体（或简称为"双元载体"），包含两个T-DNA重复序列，用户感兴趣基因将被克隆到两个T- DNA重复序列之间。第二种载体称为vir辅助质粒，负责编码将两个T- DNA重复序列之间的区域整合到植物细胞基因组中所必需的组分。需要通过共转化、共电转或融合的方式将这两种质粒一起导入根癌土壤杆菌中，然后使用该菌株侵染宿主植株。...

dCas9-KRAB CRISPRi（CRISPR interference）慢病毒载体系统

## 概述 CRISPR/Cas9载体属于几种新兴的基因组编辑工具之一，可以快速有效地在基因组的靶位点产生突变（另外两种应用广泛的是ZFN和TALEN）。 Cas9属于RNA引导的DNA核酸酶，是天然原核免疫系统的一部分，赋予细菌对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抗性。在细胞内，Cas9核酸酶与引导RNA（gRNA）形成复合物，该复合物通过与基因组中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用提供靶向特异性。gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因组中的靶位点。 dCas9-KRAB系统是一种用于内源性基因转录抑制的强大工具。该技术依靠生成一个没有核酸酶活性的Cas9蛋白。向Cas9的RuvC和NHN两个核酸酶结构域分别导入氨基酸突变D10A和H840A，使得Cas9蛋白失去切割DNA活性，但仍保留结合DNA的能力，这样的Cas9 称之为dCas9（Dead Cas9）。展开 >> 当dCas9被引导到某个基因的转录起始位点TSS（transcription start site）时，dCas9能够物理性阻碍RNA聚合酶的通过，导致基因沉默。...

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