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## 概述
腺病毒shRNA干扰载体系统是一种可在多种哺乳动物细胞中稳定干扰靶基因表达的高效方法。该载体不会整合到宿主细胞的基因组中,而是以游离DNA形式存在。该系统是体内应用测试的优先使用方法。
腺病毒载体来源于诱发普通感冒的腺病毒,野生型腺病毒基因组是线性双链DNA。
腺病毒重组载体构建完成后转染进入包装细胞。在包装过程中,位于两个反向重复序列(ITRs)之间的DNA片段与由包装细胞表达的病毒蛋白进一步包装成病毒颗粒。
当病毒转导宿主细胞时,两个ITR之间的外源DNA及病毒基因组一起进入细胞,并以游离DNA的形式存在于细胞核中。由人类U6启动子驱动表达的shRNA将会导致靶基因mRNA的降解。
通过改造优化,我们的腺病毒载体缺失了E1A、E1B和E3区,前两者与病毒包装相关(这两个基因已被整合到包装细胞的基因组中)。因此,运用我们的病毒载体包装出来的病毒是复制缺陷型的(只能转导靶细胞而不能自我复制),大大提高了生物安全性。
关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。...
## 概述
无肠腺病毒载体(又称辅助依赖性腺病毒载体)是比前几代腺病毒载体显著改进安全性的新一代腺病毒载体。这种载体上除了病毒复制和包装所必需的顺式作用元件外,几乎不含任何病毒序列,使得无肠腺病毒载体在体内使用时表现出极低的免疫原性和长期的转基因表达,在应用于基因治疗方面具有高度的有吸引力。此外,由于删除了病毒编码序列,该种载体的装载容量可增加至37
kb,使其可以表达大尺寸或多个的转基因。
由于无肠腺病毒载体缺乏所有病毒编码序列,成功包装重组病毒所需的病毒蛋白通过包装时的辅助病毒提供。对于无肠腺病毒载体,包含用户目的基因(GOI)的表达盒由启动子驱动,并且被克隆到两个ITR(反向重复序列)之间。此外,该载体还加入了适当长度的填充序列,以保持两个ITR之间的序列最终大小超过28
kb,这对于促进病毒颗粒的高效包装是必要的。包装时,载体上的两个ITR之前的区域通过限制性内切酶消化从质粒中释放出来。释放的片段被转染到包装细胞中,这些细胞随后通过转导辅助病毒以产生重组腺病毒颗粒。...
## 概述
我们的Tol2载体系统能高效地将外源DNA插入宿主细胞基因组中。该系统技术简单,利用质粒转染(非病毒转导)将目的基因永久整合到宿主基因组中。
该系统来源于Tol2转座子,它最初是从硬骨鱼青鳉鱼(Oryzias latipes)中分离出来的。
基于序列同源性分析,发现Tol2转座子与整个脊椎动物基因组中发现的非自主元件的hAT家族密切相关。
Tol2系统包含两个载体,一个载体被称为辅助质粒,负责编码转座酶;另一个载体被称为转座子质粒,包含两个反向末端重复序列(ITRs)以及两者之间的转座区域,需要被转座到宿主基因组中的目的基因就克隆在这个区域。
Tol2系统包含两个组分,一个组分是Tol2转座酶(通常为表达Tol2转座酶的IVT
mRNA)。另一个组分为转座子载体,包含两个反向末端重复序列(ITR)以及两者之间的转座区域,需要被转座到宿主基因组中的目的基因就克隆在这个区域。
表达Tol2转座酶的IVT mRNA和转座子载体共转染至靶细胞时,IVT
mRNA产生的转座酶将会识别转座子的两个ITR,然后将被转座区和两个ITR元件插入到宿主基因组中。...
## 概述
腺病毒载体能高效转导大多数的哺乳动物细胞,并以游离的DNA形式存在于宿主细胞中。该载体系统是把外源基因导入体内的优先使用方法,经常用于基因治疗和疫苗。
腺病毒载体来源于诱发普通感冒的腺病毒,野生型腺病毒基因组是线性双链DNA。
腺病毒重组载体构建完成后转染进入包装细胞。在包装过程中,位于两个反向重复序列(ITRs)之间的DNA片段与由包装细胞表达的病毒蛋白进一步包装成病毒颗粒。
当病毒转导宿主细胞时,两个ITR之间的外源DNA及病毒基因组一起进入细胞,并以游离DNA的形式存在于细胞核中。
通过改造优化,我们的腺病毒载体缺失了E1A、E1B和E3区,前两者与病毒包装相关(这两个基因已被整合到包装细胞的基因组中)。因此,运用我们的病毒载体包装出来的病毒是复制缺陷型的(只能转导靶细胞而不能自我复制),大大提高了生物安全性。
关于腺病毒基因表达载体的更多信息,请参考以下文献。...
## 概述
我们的Tol2载体系统可以非常有效地将外源DNA插入到宿主细胞的基因组中。该系统技术简单,利用质粒转染或电转的方法可将您感兴趣的基因永久整合到宿主基因组中。
该系统来源于Tol2转座子,它最初是从硬骨鱼青鳉鱼(Oryzias latipes)中分离出来的。
基于序列同源性分析,发现Tol2转座子与整个脊椎动物基因组中发现的非自主元件的hAT家族密切相关。
Tol2系统包含两个载体,一个载体被称为辅助质粒,负责编码转座酶;另一个载体被称为转座子质粒,包含两个反向末端重复序列(ITRs)以及两者之间的转座区域,需要被转座到宿主基因组中的目的基因就克隆在这个区域。
当辅助质粒和转座子质粒共转染靶细胞时,辅助质粒产生的转座酶将会识别转座子的两个ITR,然后将被转座区和两个ITR元件插入到宿主基因组中。Tol2转座子在宿主细胞中的插入位点没有明显碱基偏好性,这不同于具有特定靶标位点的转座子系统。如,PB转座插入通常发生在包含TTAA序列的宿主染色体位点。...
## 概述
FLEX条件性表达腺病毒载体结合了载体家的高效的腺病毒载体系统和Cre响应的FLEX条件性基因表达载体,可以帮助您实现在多种多样的哺乳动物细胞中以腺病毒转导Cre响应的FLEX基因表达调控开关。FLEX
Cre-Switch系统的两个Lox-
变体重组位点之间包含一对反向平行的ORF,在Cre重组酶的调控下ORF上的两个目的基因编码方向反转,从而让一个目的基因从激活表达变成沉默,另一个目的基因从沉默变成激活表达。
FLEX Cre-switch系统由两对异型Lox-变体重组位点组成,其中野生型序列称为LoxP,突变体称为Lox2272,分别位于两个基因ORF的两侧。
两个ORF相互反向,其中一个ORF具有正确的读码方向(相对于启动子)。两种Lox-变体都可被Cre识别,但只有相同的Lox位点对可以彼此重组,与其他Lox-
变体不能进行重组。LoxP和Lox2272位点以交替方式位于两个ORF两端,每对位点互为反向。Cre重组酶不存在的情况时,第一个ORF由于其编码方向与启动子方向相同,可以在客户定制的启动子驱动下正常表达,而第二个ORF由于其方向相反则无法正常表达。...
## 概述
CRISPR/Cas9(规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白9)核酸酶表达载体属于几种新兴的基因组编辑工具之一(另外两种是ZFN和TALEN),可在基因组的靶位点快速有效地产生突变。这些质粒载体编码的特异性RNA,能够引导DNA核酸酶(或缺刻酶)编辑基因组中特定位点的DNA序列。
Cas9是RNA引导DNA核酸酶,是天然原核免疫系统的一部分,赋予细菌产生对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抵抗能力。在细胞内,Cas9核酸酶与引导RNA(gRNA)形成复合物,该复合物通过与基因组中的18-22nt的同源靶序列直接相互作用,gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上,然后切割基因组中的靶位点。
使用CRISPR打靶目的基因需要目标细胞同时表达Cas9和特异gRNA。这可以通过在同一个载体上共表达Cas9和gRNA,也可以通过在两个载体各上自表达Cas9和gRNA来实现。使用Cas9和gRNA两个载体分开表达的优势在于可使用不同的gRNA与不同的Cas9变体组合(如野生型Cas9,Cas9n,dCas9),从而根据实验目的带来更多变的实验方案。...
## 概述
MMLV逆转录病毒基因表达载体系统是一种非常高效的,能把外源基因稳定整合到哺乳动物细胞基因组的系统,也是在iPS细胞制备中特别受欢迎的基因转导方法。
MMLV逆转录病毒载体来源于莫洛尼(氏)鼠白血病病毒,属于逆转录病毒家族,野生型逆转录病毒基因组是线性双正链RNA。
MMLV逆转录病毒重组载体构建完成后与辅助质粒一起转染进入包装细胞。在包装细胞中,位于两个长末端重复序列(LTRs)之间的DNA片段会被转录成RNA,由辅助质粒表达的病毒蛋白将其包装形成病毒颗粒。包装后的活体病毒将会被释放到上清液中,可以直接收集或进一步浓缩病毒转染靶细胞。
当病毒转导靶细胞时,释放到宿主细胞中的病毒RNA借助逆转录酶逆转录成DNA,然后随机整合进宿主细胞的基因组中。在病毒载体中,位于两个LTR的DNA片段和病毒基因组都会稳定整合到靶细胞的基因组中。
通过改造优化,我们的MMLV逆转录病毒载体删除了与病毒包装和转导相关的基因(这些基因由辅助质粒进行表达,用于病毒包装过程)。因此,通过逆转录病毒载体包装产生的病毒是复制缺陷型的(只能转导靶细胞而不能自我复制),具有非常高的生物安全性。...
## 概述
我们的体外转录载体是简单有效的RNA转录系统,适用于各种研究。长RNA体外转录载体可用于产生RNA探针(即核糖核酸探针),用于原位杂交。
该系统结合了T7和SP6启动子,您的目的序列将被克隆在这两个启动子之间。在适当的反应条件和三磷酸核苷酸的存在下,T7噬菌体RNA聚合酶(T7
RNAP)或SP6
RNAP可以促进高效合成核糖核酸探针。这两个启动子方向相反,一个启动子将产生有义转录物,另一个将产生反义转录物。根据插入片段的方向和实验目的,用户可以选择使用T7
RNAP、SP6
RNAP或两者一起进行体外转录。T7和SP6启动子侧翼序列也可用作PCR扩增或测序的引物结合位点。通过利用半抗原标记的或荧光基团标记的或是放射性标记的核苷酸进行转录,以便于原位杂交探针定位检测。我们建议您参考已发表文献中经测试的体外转录和原位杂交步骤说明来进行实验。
T7和SP6
RNAP对于有效的转录起始均具有碱基要求,且这些碱基已经被放置到载体上。T7启动子3'末端的前两个碱基是GG,紧接着是客户的目的序列;SP6启动子3'末端的前三个碱基是GAA,紧接着是客户的目的序列。...
## 概述
我们的睡美人(Sleeping
beauty)转座子载体系统可以高效地将外源DNA插入宿主细胞基因组。该系统在技术上十分简洁,仅需要进行质粒转染(无需病毒转导)即可永久性地对宿主细胞基因组插入您的目的基因。
该载体的转座子系统来源于Tc1/mariner转座子超家族,一开始是从鱼类基因组分离出来,并且经过了大量的累积突变已失去转座子活性。睡美人转座子通过移除鲑鱼基因组的Tc1/mariner转座子上的这些失活突变,重新构筑出有活性的转座子。该方法合成的转座子提供了一种在脊椎动物中高效地进行基因转导和插入突变的方法。
睡美人转座子载体系统包含两个组分。一个组分是Sleeping beauty转座酶(通常为表达Sleeping beauty转座酶的IVT
mRNA)。另一个组分则是转座子载体,包含由两个反向/正向重复序列(IR/DR)包围的转座子区域。需要被递送至宿主细胞的基因被克隆至该区域。...