载体指南

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## 概述 CRISPR/Cas9（规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白9）核酸酶表达载体属于几种新兴的基因组编辑工具之一（另外两种是ZFN和TALEN），可在基因组的靶位点快速有效地产生突变。这些质粒载体编码的特异性RNA，能够引导DNA核酸酶（或缺刻酶）编辑基因组中特定位点的DNA序列。 Cas9是RNA引导DNA核酸酶，是天然原核免疫系统的一部分，赋予细菌产生对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抵抗能力。在细胞内，Cas9核酸酶与引导RNA（gRNA）形成复合物，该复合物通过与基因组中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用，gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因组中的靶位点。为了方便使用，我们设计的CRISPR/Cas9载体能够在一个载体上同时有效表达Cas9核酸酶（或缺刻酶）和引导RNA（gRNA）。使用CRISPR打靶目的基因需要目标细胞同时表达Cas9和特异gRNA。这可以通过在同一个载体上共表达Cas9和gRNA，也可以通过在两个载体各上自表达Cas9和gRNA来实现。...

哺乳动物基因Tet-On诱导表达质粒载体（Low leak）

## 概述 Tet-On诱导型基因表达系统是控制哺乳动物细胞中目的基因定时表达的强大工具。Tet- On诱导型基因表达载体作用：当不存在四环素及其类似物（如doxycycline）的情况下，目的基因几乎或完全沉默；当往体系中添加四环素或其他类似物（如doxycycline）时，目的基因得到快速高水平表达。四环素不存在的情况下时，衍生于TeR（Tet抑制蛋白）和KRAB- AB（Kid-1蛋白转录抑制结构域）的融合蛋白tTS结合TRE启动子，导致基因转录抑制。另一方面，四环素存在时，衍生于突变型Ter抑制蛋白和VP16蛋白（转录激活结构域）的融合蛋白rtTA结合TRE启动子，激活基因转录。除了以tTS和rtTA融合蛋白作为基因转录激活的开关的标准Tet-On载体系统，我们还提供专门为组织特异表达设计低泄露型（Low leak）Tet- On载体系统。这种实验通常要求在靶组织处四环素存在，而非靶组织处无四环素作用。该载体上存在三个表达盒：1. TRE启动子驱动的GOI表达；2. 通用启动子驱动的tTS基因表达；3. 用户自定义启动子驱动的rtTA基因表达。...

毕赤酵母蛋白表达载体

## 概述我们的毕赤酵母重组蛋白表达载体系统有着非常强大高效的重组蛋白表达能力。毕赤酵母作为一种甲基营养型酵母，被广泛应用在蛋白产品的研究和工业应用上。在该载体系统中，目的基因通常被克隆在甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子（GAP）和乙醇氧化酶1启动子（AOX1）的下游，这取决于基因的基本结构和表达诱导条件的要求。GAP是一个强大的组成型启动子，而AOX1则是受甲醇严格高效调控的启动子，这两个启动子都能够介导目的基因的高水平表达，目的蛋白的累加总量往往可达总细胞可溶性蛋白的30%以上。一般来说，GAP启动子的表达能力略强于诱导状态下的AOX1启动子。我们建议您做一个时间曲线测试，以确定表达目的蛋白的最佳启动子类型。与酿酒酵母不同的是，毕赤酵母以甲醇为基础碳源，能更高水平地介导重组蛋白的表达（通常是酿酒酵母的的10-100倍）。另外，毕赤酵母和酿酒酵母在技术上有许多共通之处（如互补作用），通用的基因注释和遗传命名法简化了两个物种的研究。关于该载体系统的更多信息，请参考以下文献。...

线虫ttTi5605基因座表达载体

ttTi5605基因座表达载体是一种经过良好验证的可用于线虫的特定位点的外源基因单拷贝插入的高效系统。该系统使用Mos1转座子剪切机制或CRISPR机制向线虫引入稳定整合的外源基因插入。 Mos1转座子首先在果蝇（Drosophila mauritiana）中被发现。当前，相当一部分的线虫种属已经被开发出包含确定的Mos1转座子插入位点。一个例子是基因组ttTi5605区域包含了Mos1位点的线虫种属。使用ttTi5605基因座的原因在于在该区域插入序列不会扰乱临近基因的功能。此外，Mos1转座子剪切技术可以将外源基因以单拷贝的方式插入基因组，不容易被线虫自身的RNAi系统沉默（重复元件序列通常易被细胞转录抑制）。Mos1介导的ttTi5605位点的基因特异性重组需要ttTi5605基因座表达载体与一个表达转座酶的辅助质粒共转染线虫。通过热激法可以激活转座酶活性，从而导致Mos1转座子在线虫基因组发生剪切。断开的DNA双链可以被外部提供的序列修复并产生稳定的基因重组。...

哺乳动物shRNA干扰AAV载体

## 概述我们的腺相关病毒（adeno-associated virus，简称AAV）shRNA干扰载体系统是一种非常高效的能稳定在体内和体外干扰各种哺乳动物细胞靶基因表达的载体工具。AAV的免疫原性极低，在体内几乎没有致病性，使得AAV成为许多动物研究的理想工具。 AAV重组载体构建完成后与辅助质粒一起转染进入包装细胞。在包装细胞中，位于两个反向重复序列（ITRs）之间的DNA片段与辅助质粒表达的病毒蛋白进一步包装成病毒颗粒。当病毒转导宿主细胞时，两个ITR之间的外源DNA及病毒基因组一起进入细胞，线性双链DNA基因组以游离DNA的形式存在于细胞核中。由人类U6启动子驱动表达的shRNA将会导致靶基因mRNA的降解。在大多数情况下，可以在生物安全1级（BSL1）设施中处理AAV。AAV是复制缺陷型的、不会引起炎症反应和引发人类疾病。人们已从自然界中鉴定出许多AAV病毒株，根据病毒表面衣壳蛋白的不同抗原将它们分成不同的血清型。不同血清型的病毒具有不同的组织亲和性（即感染组织特异性）。当我们的AAV载体使用不同的衣壳蛋白包装病毒时，则会赋予病毒不同的血清型。...

哺乳动物基因FLEX条件性表达慢病毒载体（Cre-On）

## 概述 FLEX条件性表达慢病毒载体结合了载体家的高效的第三代慢病毒载体系统和Cre响应的FLEX条件性基因表达载体，帮助您实现在病毒宿主基因组上永久整合Cre重组酶响应的FLEX Cre-On基因调控开关。FLEX Cre-On系统利用位于目的基因两侧的Lox- 变体重组位点，在Cre重组酶的调控下目的基因发生反转，目的基因正常表达；而Cre不存在的情况下，目的基因不表达。 FLEX Cre-On系统由两对异型Lox- 变体重组位点组成，其中野生型序列称为LoxP，突变体称为Lox2272，分别位于反向基因ORF（相对启动子方向而言）的两侧。两种Lox- 变体都可被Cre识别，但只有相同的Lox位点对可以彼此重组，与其他Lox-变体不能进行重组。 LoxP和Lox2272位点以交替方式位于ORF两端，每对位点互为反向。...

哺乳动物基因FLEX条件性表达慢病毒载体（Cre-Off）

Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli. ## 概述 FLEX条件性表达慢病毒载体结合了载体家的高效的第三代慢病毒载体系统和Cre响应的FLEX条件性基因表达载体，帮助您实现在病毒宿主基因组上永久整合Cre重组酶响应的FLEX Cre-Off基因调控开关。FLEX Cre-Off系统利用位于目的基因两侧的Lox- 变体重组位点，在Cre重组酶的调控下目的基因发生反转，目的基因正常表达；而Cre不存在的情况下，目的基因不表达。 FLEX Cre-Off系统由两对异型Lox-变体重组位点组成，其中野生型序列称为LoxP，突变体称为Lox2272，分别位于ORF的两侧。两种Lox- 变体都可被Cre识别，但只有相同的Lox位点对可以彼此重组，与其他Lox-变体不能进行重组。 LoxP和Lox2272位点以交替方式位于ORF两端，每对位点互为反向。Cre重组酶不存在的情况下，客户定制的启动子可以驱动目的基因的正常表达。...

哺乳动物shRNA干扰腺病毒载体

## 概述腺病毒shRNA干扰载体系统是一种可在多种哺乳动物细胞中稳定干扰靶基因表达的高效方法。该载体不会整合到宿主细胞的基因组中，而是以游离DNA形式存在。该系统是体内应用测试的优先使用方法。腺病毒载体来源于诱发普通感冒的腺病毒，野生型腺病毒基因组是线性双链DNA。腺病毒重组载体构建完成后转染进入包装细胞。在包装过程中，位于两个反向重复序列（ITRs）之间的DNA片段与由包装细胞表达的病毒蛋白进一步包装成病毒颗粒。当病毒转导宿主细胞时，两个ITR之间的外源DNA及病毒基因组一起进入细胞，并以游离DNA的形式存在于细胞核中。由人类U6启动子驱动表达的shRNA将会导致靶基因mRNA的降解。通过改造优化，我们的腺病毒载体缺失了E1A、E1B和E3区，前两者与病毒包装相关（这两个基因已被整合到包装细胞的基因组中）。因此，运用我们的病毒载体包装出来的病毒是复制缺陷型的（只能转导靶细胞而不能自我复制），大大提高了生物安全性。关于该载体系统的更多信息，请参考以下文献。...

无肠腺病毒基因表达载体

## 概述无肠腺病毒载体（又称辅助依赖性腺病毒载体）是比前几代腺病毒载体显著改进安全性的新一代腺病毒载体。这种载体上除了病毒复制和包装所必需的顺式作用元件外，几乎不含任何病毒序列，使得无肠腺病毒载体在体内使用时表现出极低的免疫原性和长期的转基因表达，在应用于基因治疗方面具有高度的有吸引力。此外，由于删除了病毒编码序列，该种载体的装载容量可增加至37 kb，使其可以表达大尺寸或多个的转基因。由于无肠腺病毒载体缺乏所有病毒编码序列，成功包装重组病毒所需的病毒蛋白通过包装时的辅助病毒提供。对于无肠腺病毒载体，包含用户目的基因（GOI）的表达盒由启动子驱动，并且被克隆到两个ITR（反向重复序列）之间。此外，该载体还加入了适当长度的填充序列，以保持两个ITR之间的序列最终大小超过28 kb，这对于促进病毒颗粒的高效包装是必要的。包装时，载体上的两个ITR之前的区域通过限制性内切酶消化从质粒中释放出来。释放的片段被转染到包装细胞中，这些细胞随后通过转导辅助病毒以产生重组腺病毒颗粒。...

哺乳动物基因FLEX条件性表达腺病毒载体（Cre-On）

## 概述 FLEX介导条件性表达腺病毒载体结合了载体家的高效的腺病毒载体系统和Cre响应的FLEX条件性基因表达载体，可以帮助您实现在多种多样的哺乳动物细胞中以腺病毒转导Cre响应的FLEX基因表达调控开关。FLEX Cre-On系统利用位于目的基因两侧的Lox- 变体重组位点，在Cre重组酶的调控下目的基因发生反转，目的基因正常表达；而Cre不存在的情况下，目的基因不表达。 FLEX Cre-On系统由两对异型Lox- 变体重组位点组成，其中野生型序列称为LoxP，突变体称为Lox2272，分别位于反向基因ORF（相对启动子方向而言）的两侧。两种Lox- 变体都可被Cre识别，但只有相同的Lox位点对可以彼此重组，与其他Lox-变体不能进行重组。 LoxP和Lox2272位点以交替方式位于ORF两端，每对位点互为反向。...

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