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## 概述
CRISPR/Cas9(规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白9)核酸酶表达载体属于几种新兴的基因组编辑工具之一(另外两种是ZFN和TALEN),可在基因组的靶位点快速有效地产生突变。这些质粒载体编码的特异性RNA,能够引导DNA核酸酶(或缺刻酶)编辑基因组中特定位点的DNA序列。
Cas9是RNA引导DNA核酸酶,是天然原核免疫系统的一部分,赋予细菌产生对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抵抗能力。在细胞内,Cas9核酸酶与引导RNA(gRNA)形成复合物,该复合物通过与基因组中的18-22nt的同源靶序列直接相互作用,gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上,然后切割基因组中的靶位点。为了方便使用,我们设计的CRISPR/Cas9载体能够在一个载体上同时有效表达Cas9核酸酶(或缺刻酶)和引导RNA(gRNA)。
使用CRISPR打靶目的基因需要目标细胞同时表达Cas9和特异gRNA。这可以通过在同一个载体上共表达Cas9和gRNA,也可以通过在两个载体各上自表达Cas9和gRNA来实现。...
#### 概述
慢病毒载体系统是一种能非常高效的把外源基因稳定整合到哺乳动物细胞中的载体工具。除了常规质粒转染外,目前该系统也是把外源基因转入哺乳动物细胞的最常用方法之一。由于具有目的基因和启动子选择的灵活性以及转染细胞类型的广泛性两大特点,使得慢病毒载体系统成为倍受欢迎的外源基因表达系统。
慢病毒载体来源于人类免疫缺陷病毒HIV,属于逆转录病毒家族。野生型慢病毒基因组是线性双正链RNA。
慢病毒重组载体构建完成后与辅助质粒一起转染进入包装细胞。在包装细胞中,位于两个长末端重复序列(LTR)之间的DNA片段会被转录成RNA,由辅助质粒表达的病毒蛋白将其包装形成病毒颗粒。包装后的活体病毒将会被释放到上清液中,可以直接收集或进一步浓缩病毒转染靶细胞。
当病毒转导靶细胞时,释放到宿主细胞中的病毒RNA借助逆转录酶逆转录成双链DNA,然后随机整合进宿主细胞的基因组中。在病毒载体中,位于两个LTR的DNA片段和病毒基因组都会稳定整合到靶细胞的基因组中。...
## 概述
慢病毒shRNA干扰载体系统是一种非常高效的,能稳定干扰各种哺乳动物细胞靶基因表达的载体工具。一旦病毒基因组被逆转录成DNA并永久整合到宿主细胞基因组中,由人类U6启动子驱动表达的shRNA将会导致靶基因mRNA的降解。与合成siRNA相比,慢病毒干扰具有明显的优势(见下文载体优势)。
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通过改造优化,我们的慢病毒载体删除了与病毒包装和转导相关的基因(这些基因由辅助质粒进行表达,用于病毒包装过程),使产生的慢病毒颗粒是复制缺陷型的。即包装的病毒只具有转导靶细胞的能力,而无法在靶细胞中进行大量复制,因而具有很高的生物安全性。
更多信息请查阅"慢病毒基因表达载体",关于慢病毒shRNA干扰载体的更多信息,请参考以下文献。
参考文献 | 主题
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RNA. 9:493-501 (2003) | Development of lentiviral shRNA vectors
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## 亮点
我们的慢病毒shRNA干扰载体采用的是第三代慢病毒包装载体系统。...
## 概述
我们的pUASTB载体系统是一个高效的转基因果蝇制备和基因表达控制系统。该系统能够利用果蝇P元件转座子系统(如pUAST)或噬菌体φC31整合系统(如pUASTattB)并结合强诱导型启动子Gal4调节转基因的表达。因此,pUASTB载体系统可用于P转座子和φC31整合酶介导目的基因插入。目的基因会被克隆到pUASTB两个P-
元件末端重复序列中间和attB重组位点附近的区域。
为了实现P转座子介导的插入,将pUASTB质粒和表达P转座酶的辅助质粒共同导入宿主细胞或胚胎中。
接着,由辅助质粒产生的转座酶识别pUASTB质粒上的两个P元件末端重复序列,并将包含两个P元件末端重复之间的序列插入宿主基因组中。
为了实现φC31整合酶介导的插入,将pUASTB质粒和表达φC31整合酶的辅助质粒共同导入宿主细胞或含有attP位点的胚胎中。φC31整合酶介导attB和attP位点之间的不可逆重组,导致pUASTB载体线性化并整合到宿主基因组中。
mini white基因的表达,可以使果蝇的眼色发生变化,是鉴定转基因果蝇成功与否的标记。...
## 概述
慢病毒载体系统是一种能非常高效的把外源基因稳定整合到哺乳动物细胞中的载体工具。除了常规质粒转染外,目前该系统也是把外源基因转入哺乳动物细胞的最常用方法之一。由于具有目的基因和启动子选择的灵活性以及转染细胞类型的广泛性两大特点,使得慢病毒载体系统成为倍受欢迎的外源基因表达系统。
慢病毒载体来源于人类免疫缺陷病毒HIV,属于逆转录病毒家族。野生型慢病毒基因组是线性双正链RNA。
慢病毒重组载体构建完成后与辅助质粒一起转染进入包装细胞。在包装细胞中,位于两个长末端重复序列(LTR)之间的DNA片段会被转录成RNA,由辅助质粒表达的病毒蛋白将其包装形成病毒颗粒。包装后的活体病毒将会被释放到上清液中,可以直接收集或进一步浓缩病毒转染靶细胞。
当病毒转导靶细胞时,释放到宿主细胞中的病毒RNA借助逆转录酶逆转录成双链DNA,然后随机整合进宿主细胞的基因组中。在病毒载体中,位于两个LTR的DNA片段和病毒基因组都会稳定整合到靶细胞的基因组中。...
## 概述
CRISPR/Cas9(规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白9)核酸酶表达载体属于几种新兴的基因组编辑工具之一(另外两种是ZFN和TALEN),可在基因组的靶位点快速有效地产生突变。这些质粒载体编码的特异性RNA,能够引导DNA核酸酶(或缺刻酶)编辑基因组中特定位点的DNA序列。
Cas9是RNA引导DNA核酸酶,是天然原核免疫系统的一部分,赋予细菌产生对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抵抗能力。在细胞内,Cas9核酸酶与引导RNA(gRNA)形成复合物,该复合物通过与基因组中的18-22nt的同源靶序列直接相互作用,gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上,然后切割基因组中的靶位点。
使用CRISPR打靶目的基因需要目标细胞同时表达Cas9和特异gRNA。这可以通过在同一个载体上共表达Cas9和gRNA,也可以通过在两个载体各上自表达Cas9和gRNA来实现。使用Cas9和gRNA两个载体分开表达的优势在于可使用不同的gRNA与不同的Cas9变体组合(如野生型Cas9,Cas9n,dCas9),从而根据实验目的带来更多变的实验方案。...
## 概述
该载体系统设计用于在小鼠模型中,高效分析哺乳动物增强子。通常情况下,将感兴趣的增强子克隆到该载体小鼠最小启动子Hsp68的上游,并将构建好的载体用于制备转基因小鼠。对转基因胚胎或成年小鼠中LacZ报告基因的表达情况进行检测,可以进一步分析增强子的活性。
PB转座子载体系统可以非常高效地把外源DNA插入哺乳动物细胞的基因组,该系统技术简单,可利用质粒转染(非病毒转导)把您所感兴趣的基因长期稳定地整合到靶细胞基因组。
PB转座系统包含两个载体,一个载体被称为辅助质粒,负责编码转座酶;另一个载体被称为转座子质粒,包含两个末端重复序列(TR)以及两者之间的被转座区域,需要被转座到宿主基因组中的目的基因就克隆在这个区域。当辅助质粒和转座子质粒共转染靶细胞时,辅助质粒产生的转座酶将会识别转座子的两个TR元件,然后将被转座区和两个TR元件插入到宿主基因组中。转座插入通常发生在包含TTAA序列的宿主染色体位点,并在转座子两侧出现TTAA重复序列。...
## 概述
Tet-On诱导型基因表达系统是控制哺乳动物细胞中目的基因定时表达的强大工具。Tet-
On诱导型基因表达载体作用:当不存在四环素及其类似物(如doxycycline)的情况下,目的基因几乎或完全沉默;当往体系中添加四环素或其他类似物(如doxycycline)时,目的基因得到快速高水平表达。四环素不存在的情况下时,衍生于TeR(Tet抑制蛋白)和KRAB-
AB(Kid-1蛋白转录抑制结构域)的融合蛋白tTS结合TRE启动子,导致基因转录抑制。另一方面,四环素存在时,衍生于突变型Ter抑制蛋白和VP16蛋白(转录激活结构域)的融合蛋白rtTA结合TRE启动子,激活基因转录。
除了以tTS和rtTA融合蛋白作为基因转录激活的开关的标准Tet-On载体系统,我们还提供专门为组织特异表达设计低泄露型(Low leak)Tet-
On载体系统。这种实验通常要求在靶组织处四环素存在,而非靶组织处无四环素作用。该载体上存在三个表达盒:1. TRE启动子驱动的GOI表达;2.
通用启动子驱动的tTS基因表达;3.
用户自定义启动子驱动的rtTA基因表达。...
## 概述
我们的毕赤酵母重组蛋白表达载体系统有着非常强大高效的重组蛋白表达能力。毕赤酵母作为一种甲基营养型酵母,被广泛应用在蛋白产品的研究和工业应用上。
在该载体系统中,目的基因通常被克隆在甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(GAP)和乙醇氧化酶1启动子(AOX1)的下游,这取决于基因的基本结构和表达诱导条件的要求。GAP是一个强大的组成型启动子,而AOX1则是受甲醇严格高效调控的启动子,这两个启动子都能够介导目的基因的高水平表达,目的蛋白的累加总量往往可达总细胞可溶性蛋白的30%以上。一般来说,GAP启动子的表达能力略强于诱导状态下的AOX1启动子。我们建议您做一个时间曲线测试,以确定表达目的蛋白的最佳启动子类型。
与酿酒酵母不同的是,毕赤酵母以甲醇为基础碳源,能更高水平地介导重组蛋白的表达(通常是酿酒酵母的的10-100倍)。另外,毕赤酵母和酿酒酵母在技术上有许多共通之处(如互补作用),通用的基因注释和遗传命名法简化了两个物种的研究。
关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。...
## 概述
CRISPR/Cas9(规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白9)核酸酶表达载体属于几种新兴的基因组编辑工具之一(另外两种是ZFN和TALEN),可在基因组的靶位点快速有效地产生突变。这些质粒载体编码的特异性RNA,能够引导DNA核酸酶(或缺刻酶)编辑基因组中特定位点的DNA序列。
Cas9是RNA引导DNA核酸酶,是天然原核免疫系统的一部分,赋予细菌产生对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抵抗能力。在细胞内,Cas9核酸酶与引导RNA(gRNA)形成复合物,该复合物通过与基因组中的18-22
nt的同源靶序列直接相互作用,gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上,然后切割基因组中的靶位点。为了方便使用,我们设计的CRISPR/Cas9载体能够在一个载体上同时有效表达Cas9核酸酶(或缺刻酶)和引导RNA(gRNA)。
使用CRISPR打靶目的基因需要目标细胞同时表达Cas9和特异gRNA。这可以通过在同一个载体上共表达Cas9和gRNA,也可以通过在两个载体各上自表达Cas9和gRNA来实现。...