腺病毒体内应用

背景

在过去的几十年间， 复制缺陷的人类重组腺病毒V5（HadV5） 已 经成为一种广泛应用在真核基因表达分析、疫苗研究和基因治疗等 领域的模式系统。 这种经修饰后的腺病毒，其E1和E3基因已被移 除，依然具备细胞感染的能力。而用于产生新的病毒颗粒或者说病毒粒子的必需基因不复存在。

利用腺病毒将基因物质传递到宿主细胞具有很多优势。在体内以及 体外，重组腺病毒都能被用于转导多种哺乳动物（尤其是人类）的 分裂期细胞和休眠细胞。此外，重组腺病毒还能用于转导多种类型 的敏感型细胞。

人类AdV5感染起始于纤维蛋白与细胞表面的coxsackie腺病毒受体 （coxsackie-adenovirus receptor， CAR）高度亲和性的结合。 与CAR受体初始作用之后，腺病毒亚基上一个暴露的RGD结构域与 细胞表面的av整联蛋白相结合而触发内吞作用，病毒颗粒通过该内 吞作用发生内化。内化之后， 衣壳蛋白继续分裂并释放出蛋白VI， 该蛋白将衣壳蛋白从核内体中释放出来进入细胞液， 并与动力蛋白 相互作用，之后通过动力蛋白依赖的转运方式沿着微管到达核孔复 合体（NPC）。病毒颗粒与NPC上蛋白的联合似乎进一步推动了病毒颗粒的脱壳，继而允许基因组转移到细胞核中。

进入细胞核之后，病毒DNA保持染色体游离状态（病毒DNA不与 宿主染色体进行整合，因而不会引起宿主基因的活化或者失活）。

图1. 腺病毒转导机制的示意图。

交付内容

下表为定制化腺病毒产品的交付内容。可在相关COA（Certificate of analysis document）文件查看病毒滴度。

产品类型交付内容产品规格应用范围
小规格包装定制病毒浓缩病毒 （＞1010 IFU/ml，10×25 µl，HBSS保存液）体外培养细胞
对照病毒浓缩病毒 （＞1010 IFU/ml，1×100 µl，HBSS保存液）体外培养细胞
中规格包装定制病毒浓缩病毒 （＞1010 IFU/ml，10×100 µl，HBSS保存液）体外培养细胞
对照病毒浓缩病毒 （＞1010 IFU/ml，2×100 µl，HBSS保存液）体外培养细胞
大规格包装定制病毒浓缩病毒 （＞1011 IFU/ml，10×100 µl，HBSS保存液）体外培养细胞
对照病毒浓缩病毒 （＞1010 IFU/ml，2×100 µl，HBSS保存液）体外培养细胞
大规格包装和超纯化定制病毒超纯化病毒 （＞1012 VP/ml，10×100 µl，GTS保存液）动物体内
对照病毒超纯化病毒 （＞1012 VP/ml，10×100 µl，GTS保存液） （选购）动物体内

若病毒被用于体外细胞培养，则无需进行超纯化处理。 若被用于体内研究 （即动物研究），则必须进行超纯化处理以去除有缺陷的病毒颗粒、 细胞碎片以及少量的培养基， 这些污染物会引起强烈的免疫反应。 此外，超纯化可将病毒浓缩用于体内注 射的适宜浓度。

接收病毒后的处理

1. 腺病毒产品使用干冰冷藏运输。收到病毒后，可直接放置-80°C冷冻保存至少1年，也可放置-20°C冷冻保存2-3周。

2. 使用前，将病毒液放置冰上进行融解。实验过程中，亦需保持冰上放置。融解后的腺病毒液可放置4°C保存1-2周（在4°C 条件下，腺病毒比慢病毒相对稳定，一般不会出现显著的活性降低问题）。

3. 若实际用量较少，可将融解的腺病毒少量分装多管，再放置-80°C冷冻保存。如果您需要对腺病毒进行稀释，请使用 PBS现稀释现用。

注意： 应避免反复冻融。虽然反复冻融2-3次不会使腺病毒滴度出现严重下降问题，但是请尽量避免反复冻融。

安全须知

所有VectorBuilder的腺病毒载体均缺失了E1A、E1B和E3基因。E1A和E1B是产生活病毒所必需的， 已通过生物工程的方法 导入包装细胞的基因组中。因此，此类载体产生的腺病毒由于存在复制缺陷性而具有重要的安全特性，这也就意味着被感染的细胞不能复制出新的病毒颗粒。尽管如此，腺病毒本身具有转导人原代细胞的能力，理论上仍有生物危险的风险。腺病毒作为常见的人类病原体，可引发呼吸道炎症、角膜损伤和角膜结膜损伤等。我们建议按照BSL-2规范（Biosafety Level-2， 二级生物安全防护水平） 对腺病毒进行操作。所有的操作、 储存以及生物废料的处理均需依照公共机构发布的和所处机构制定的规范条例。建议用户勿生产致癌的活腺病毒。

鼠尾静脉注射方案

通过侧尾静脉进行静脉注射是一种将重组腺病毒转导到小鼠肝脏的有效方式。该方法简单，无需进行手术和麻醉。其他的注射点还包括门静脉和颈静脉。但是，门静脉注射需要手术； 在将腺病毒运送到肝脏中，较之于尾静脉注射，该方法的效果并未显著增强。

为确定适用于您研究的最佳注射效果，您需要在动物中利用报告腺病毒进行位点测试，如表达EGFP的腺病毒。

材料
  • 成年小鼠，20~25 g重，至少6周龄
  • 超纯化腺病毒
  • 70%乙醇
  • 热源
  • 小鼠专用固定器
  • 纱布
  • 0.5 ml注射器＋27 guage 1/2 inch针头
操作流程

1. 物理固定

  • 可利用一种商品的固定器将小鼠进行物理固定。温和地将待注射的小鼠引诱到固定器内，暴露出鼠尾以便进行后续操作。

2. 血管舒张

  • 温暖小鼠诱导周围血管舒张，可在注射前将鼠尾浸没于热水中（43°C）或者将动物放置在靠近热灯源的位置5~10分钟。
  • 注意：使用热灯源时，将灯源放置在鼠笼15~25 cm处，观察小鼠5分钟。若小鼠均聚集到笼子中的某个角落，立即停止 供热。

3. 注射

  • 保证小鼠放置固定器中胸骨的位置。轻轻转动尾部以能看到侧尾静脉。用70%乙醇对待注射位点进行消毒并用纱布擦拭 多余的乙醇。
  • 使用带有27 guage针头的0.5ml注射器，吸取至少0.1 ml 滴度为2×1011 ~1×1012 VP/ml的超纯化腺病毒颗粒（病毒颗粒总量约2~10×1010个）。小心挤出针头中的空气。
    抓住远端尾部并轻轻转向一边以能看到侧面静脉 （见图2）。 以较小的角度插入针头（尾静脉相对靠近表皮）， 将0. 1 ml稀释后的重组腺病毒注射到静脉中。若针头定位准确，则注射过程畅通无阻，且静脉颜色呈现短暂的清晰状态。一旦观察到局部隆起或者局部红肿，则立即停止注射，这种情况是病毒被注射到了尾部组织而非静脉。

    注意： 在尾部底端距离尾尖约1/3处开始注射。这样一旦之前注射失败，您可以向前移动尾部再次注射。

    图2. 小鼠尾外侧静脉和腹动脉横切面图。

  • 移除针头，用干净纱布按压注射点直至停止出血。
  • 将小鼠转移回原来的鼠笼。

4. 验证

  • 腺病毒颗粒在静脉注射后绝大多数会被肝脏隔离。为判断体内转导的效率，可在病毒注射72h后处死小鼠，处理肝脏来进行分析。

结果

图3所示体内转导的成功案例。

图3. 利用文中方案，用表达EGFP的超纯化慢病毒注射小鼠，病毒量为 2×1010个。注射7天后，取注射动物的2/3肝脏用于分析。图片40×。左：明视野；右图：EGFP。