AAV 腺相关病毒体内应用

交付内容

下表为定制化的超纯化腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）产品的交付内容。可在相关COA（Certificate of analysis document）⽂件查看病毒滴度。

产品类型交付内容产品规格
超纯化⼩量定制病毒浓缩病毒 (>1013 GC/ml,4x25 ul,PBS buffer)
对照病毒（可选）浓缩病毒 (>1013 GC/ml,4x25 ul,PBS buffer)
超纯化中量定制病毒浓缩病毒 (>1013 GC/ml,10x50 ul,PBS buffer)
对照病毒（可选）浓缩病毒 (>1013 GC/ml,10x50 ul,PBS buffer)
超纯化⼤量定制病毒浓缩病毒 (>1013 GC/ml,10x100 ul,PBS buffer)
对照病毒（可选）浓缩病毒 (>1013 GC/ml,10x100 ul,PBS buffer)

注意：如果腺相关病毒应⽤于体外细胞实验，超纯化处理不是必须的。对于体内研究（动物实验），使⽤超纯化的、⽆杂质（⽆活性 的病毒颗粒、细胞碎⽚和培养液成分）的腺相关病毒在避免引发强免疫反应⽅⾯⾄关重要。此外，超纯化处理可提升病毒滴度⾄ 适合体内实验的⽔平。

接收病毒后的处理

1. 腺相关病毒产品使⽤⼲冰冷藏运输。收到病毒后，可直接放置-80°C冷冻保存⾄少1年， 也可放置-20°C冷冻保存2-3周。

2. 使⽤前，将病毒液放置冰上进⾏融解。实验过程中，亦需保持冰上放置。融解后的腺相关病毒可放置4°C保存1-2周（在4°C条件 下，腺相关病毒⽐慢病毒相对稳定，⼀般不会出现显著的活性降低问题）。

3. 若实际⽤量较少，可将融解的腺相关病毒少量分装多管，再放置80°C冷冻保存。如果您需要对腺相关病毒进⾏稀释，请使⽤ PBS现稀释现⽤。

注意：应避免反复冻融。腺相关病毒较之其他多种病毒更为稳定，尽管反复冻融不会造成其活性显著降低，但请尽量避免反复冻融。

安全须知

所有VectorBuilder的腺相关病毒的基因组是由重组转基因序列及其两侧的腺相关病毒反向末端重复序列（ITRs） 组成。 ITRs序列只占到了野⽣型腺相关病毒基因组序列的6%， 也是载体上唯⼀的腺相关病毒特异序列。⼏乎所有病毒结构基因都被删除掉， 这使得该病毒不能⾃我复制，唯有依赖腺病毒反式辅助进⾏复制。我们使⽤辅助质粒表达病毒复制相关基因，⽽不是腺病毒。通 过将3个质粒（1个携带顺式ITR元件的质粒，1个编码腺相关病毒复制酶和⾐壳蛋⽩的反式质粒以及1个表达部分腺病毒基因的 辅助质粒）同时瞬转293T细胞制备出腺相关病毒颗粒。这种⽅法可制备出不同的⾎清型腺相关病毒。重组腺相关病毒是从对⼈ 体没有致病性的野⽣型病毒改造⽽成。野⽣型腺相关病毒的复制依赖于腺病毒或者疱疹病毒，⼀旦这些辅助病毒不存在，野⽣型 病毒会稳定整合到宿主细胞基因组中。重组腺相关病毒通常主要以游离的形式存在于靶细胞中，整合效率极低。我们建议按照 BSL-2规范（BiosafetyLevel-2，⼆级⽣物安全防护⽔平）对腺相关病毒进⾏操作。所有的操作、储存以及⽣物废料的处理均需依 照公共机构发布的和所处机构制定的规范条例。

推荐的AAV组织嗜性
组织类型适⽤的AAV⾎清型
平滑肌AAV1 , AAV2 , AAV3, AAV5 , AAV6, AAV7 , AAV8 , AAV9 , AAVrh10
中枢神经系统（CNS）AAV1 , AAV2 , AAV4 , AAV5 , AAV7 , AAV8, AAV9 , AAVrh10 , AAV-PHP.eB
外周神经系统（PNS）AAV-PHP.S
脑AAV1 , AAV2 , AAV5 , AAV7 , AAV8 , AAV-DJ/8
视⽹膜AAV1 , AAV2 , AAV4 , AAV5 , AAV7 , AAV8 , AAV9 , AAVrh10 , AAV2.7m8
内⽿组织AAV1 , AAV2 , AAV6.2 , AAV8 , AAV9 , AAV2.7m8
⼼脏AAV1 , AAV4 , AAV5 , AAV6 , AAV8 , AAV9 , AAVrh10 , AAV-DJ
肺AAV1 , AAV3 , AAV4 , AAV5 , AAV6, AAV6.2 , AAV9 , AAVrh10
肝AAV1 , AAV2 , AAV3 , AAV6 , AAV6.2 , AAV7 , AAV8 , AAV9 , AAVrh10 , AAV-DJ , AAV-DJ/8
胰腺AAV1 , AAV2 , AAV6 , AAV8 , AAV9 , AAVrh10
肾AAV2 , AAV4 , AAV8 , AAV9 , AAVrh10, AAV-DJ , AAV-DJ/8
脂肪组织AAV6, AAV8 , AAV9
睾丸AAV2 , AAV9
脾AAV-DJ , AAV-DJ/8
脊神经AAV2-retro
内皮细胞AAV2-QuadYF

注意：ITR区域来源于AAV2基因组。不同的⾎清型根据⾐壳蛋⽩区分。

⼩⿏尾静脉注射⽅案

侧尾静脉注射是在⼩⿏体内导⼊AAV的⾼效⽅法。尾静脉注射操作简便，不需要⼿术或⿇醉步骤。其他注射位置，如注射⻔静脉和颈静脉，需要进⾏⼿术操作。尾静脉注射对⽐⻔静脉注射可以更⾼效地将AAV递送⾄组织。

为确定适⽤于您研究的最佳注射效果，您需要在动物中利⽤表达报告基因的AAV病毒进⾏位点测试，如表达EGFP的AAV病毒。

材料

  • 成年⼩⿏，20~25g重，⾄少6周龄
  • 超纯化腺相关病毒
  • 75%⼄醇
  • 热源
  • ⼩⿏专⽤固定器
  • 纱布
  • 0.5ml注射器+ 27G（guage）1/2 英⼨针头

操作流程

1. 物理固定

  • 可利⽤⼀种商品的固定器将⼩⿏进⾏物理固定。温和地将待注射的⼩⿏引诱到固定器内，暴露出⿏尾以便进⾏后续操作。

2. ⾎管舒张

  • 温暖⼩⿏诱导周围⾎管舒张，可在注射前将⿏尾浸没于热⽔中（43°C）或者将动物放置在靠近热灯源的位置5~10钟。
  • 注意：使⽤热灯源时，将灯源放置在⿏笼15~25cm处，观察⼩⿏5分钟。若⼩⿏均聚集到笼⼦中的某个⻆落，⽴即停⽌供热。

3. 注射

  • 保证⼩⿏放置固定器中胸⻣的位置。轻轻转动尾部以能看到尾静脉。⽤75%⼄醇对待注射位点进⾏消毒并⽤纱布擦拭多余的⼄醇。
  • 使⽤带有27G针头的0.5ml注射器， 吸取⾄少0.1ml 滴度为1012 GC/ml的超纯化腺相关病毒。⼩⼼挤出针头中的空⽓。
  • 抓住远端尾部并轻轻转向⼀边以能看到侧静脉（⻅图1）。以较⼩的⻆度插⼊针头（尾静脉相对靠近表⽪），将0.1ml稀释后 的重组腺相关病毒注射到静脉中。若针头定位准确，则注射过程畅通⽆阻，且静脉颜⾊呈现短暂的清晰状态。⼀旦观察到局 部隆起或者局部红肿，则⽴即停⽌注射，这种情况是病毒被注射到了尾部组织⽽⾮静脉。

    注意：在尾部底端距离尾尖约1/3处开始注射。这样⼀旦之前注射失败，您可以向前移动尾部再次注射。

  • 图1 ⼩⿏尾侧静脉和腹动脉横切⾯图。

  • 移除针头，⽤⼲净纱布按压注射点直⾄停⽌出⾎。
  • 将⼩⿏转移回原来的⿏笼。

4. 验证

  • AAV病毒颗粒在进⾏体内注射前均经过测序验证。为判断体内转导的效率，可在病毒注射后第7天处死⼩⿏，处理病毒感染的组织进⾏分析。

预期结果

⼀个成功的AAV体内转导结果如图2所⽰。

图2 使⽤本⽂档的⽅法⼩⿏尾静脉注射超纯化的EGFP荧光AAV9， 剂量1x1013 GC/kg。注射后第⼗天，分离⼩⿏肝脏进⾏分 析。图像使⽤荧光共聚焦显微镜拍摄。绿⾊：EGFP。蓝⾊： DAPI。

⼩⿏脑室内注射⽅案

脑室内（Intra-cerebroventricular,ICV） 注射将超纯化AAV注射⼊左、右侧脑室，随后AAV扩散⾄中枢神经系统（Centralnervoussystem,CNS）。脑室和CNS含有由两侧脑室分泌的脑脊液（Cerebrospinalfluid,CSF）。脑脊液的流动⽅向从脑室开始，最后进⼊蛛⽹膜下腔（图3）进⾏循环。由于蛛⽹膜覆盖全脑、脊髓和骶⻣，ICV注射可以不受⾎脑屏障阻碍在CNS中导⼊AAV病毒样本。

为确定适⽤于您研究的最佳注射效果，您需要在动物中使⽤⼩量表达报告基因的AAV病毒进⾏测试，如表达EGFP的AAV病毒。

图3 ⼩⿏脑脊液循环通路⽰意图

材料

  • 新⽣⿏，1-3岁周龄
  • 超纯化腺相关病毒
  • 75% ⼄醇
  • ⽆⽔⼄醇
  • 冰
  • ⼲冰
  • 纱布
  • 加热垫或保温箱
  • ⽴体定位仪
  • 33~34G（gauge） 1/2英⼨针头
  • 10ul注射器
  • 15cm均压(PE) 管

操作流程

1. 准备⼿术环境

  • 使⽤75%⼄醇擦拭⼿术台。
  • 对脑⽴体定位仪进⾏降温处理，往⼿术台的凹槽内加⼊5ml的⽆⽔⼄醇，不断往⽆⽔⼄醇中添加⼲冰使实验台保持0°C左右。同时对⼩型加热垫进⾏加热。

    注意：为避免⼩⿏死亡，⼿术环境温度应不低于0°C。

2. 准备注射器

  • 取⼀个33~34G针头与PE管套紧，再将PE管的另外⼀端与10ul注射器针头套紧。
  • 使⽤针头吸取5ul2x1012 GC/ml超纯化AAV， 然后⼩⼼排出针头中的空⽓。
  • 将注射器和针头固定于⽴体定位仪。

3. ⿇醉

  • 将⼩⿏放在冰上⿇醉4min，⾄⼩⿏基本保持不动

4. 物理固定

  • ⿇醉后，⼩⿏头部可以被物理固定于⽴体定位仪。

5. 注射

5.1 注射左脑室

  • ⽤沾有75%⼄醇的纱布擦拭⼩⿏的头部。
  • 将针头移动⾄⼩⿏的λ结构上⽅（图4）。记录下x、y坐标（x，y）。
  • 移动x和y轴的游标卡尺确定左脑室的坐标（x+1.2mm， y+1.6mm），先移动z轴使针将⼩⿏的头盖⻣刺穿，然后⽴刻回针，将针头缓慢拔出。

    注意：当针头刺穿⼩⿏头盖⻣后，由于针头施加压⼒的原因，可以稍微改变Z轴位置。刺穿头盖⻣后⽴即回针有助于帮助头盖 ⻣返回初始位置。

  • C针头拔出后⼩⼼地再放回头盖⻣中，移动z轴使针尖刚好与脑接触，记录下z轴的坐标（x+1.2mm，y+1.6mm，z1）。 此时的坐标往下移动2.5~3mm是左脑室的位置，即（x+1.2mm，y+1.6mm，z-2.5~3mm）。
  • 缓慢移动z轴，使针尖缓慢扎⼊脑室，当坐标达到了之后，缓慢推动微量注射器，直⾄注射完2.5ul的病毒样本。注射完成后 等待1min。
  • 缓慢地移动z轴将针头从脑室中拔出来。该动作应持续2min。过快拔出针头可能会导致AAV病毒液漏出。

5.2注射右脑室

  • 移动针头⾄右脑室上⽅（x-1.2mm,y+1.6mm）。通过移动z轴让针头刺穿⼩⿏头盖⻣。
  • 头盖⻣被刺穿后⽴刻回针，将针头缓慢拔出。

    注意：当针头刺穿⼩⿏头盖⻣后，由于针头施加压⼒的原因，可以稍微改变Z轴位置。刺穿头盖⻣后⽴即回针有助于帮助头盖 ⻣返回初始位置。
  • 针头拔出后⼩⼼地再放回头盖⻣中，移动z轴使针尖刚好与脑接触，记录下z轴的坐标（x+1.2mm，y+1.6mm，z1）。此时的坐标往下移动2.5~3mm是左脑室的位置，即（x-1.2mm，y+1.6mm，z-2.5~3mm）。
  • 缓慢移动z轴，使针尖缓慢扎⼊脑室，当坐标达到了之后，缓慢推动微量注射器，直⾄注射完2.5ul的病毒样本。注射完成后 等待1min。
  • 缓慢地移动z轴将针头从脑室中拔出来。该动作应持续2min。过快拔出针头可能会导致AAV病毒液漏出。

    注意：为避免⼩⿏死亡，⼩⿏不可暴露于低温环境下超过30min。

6. 复苏

  • 注射结束后，将⼩⿏做好标记，放在已预热好的⼩型加热垫上使⼩⿏体温恢复正常。

7. 术后观察

  • 待⼩⿏体温恢复正常后，将⼩⿏重新放回⿏笼中，由⺟⿏继续哺乳。观察⼩⿏的⽣存状况直⾄后续实验。

图4 ⼩⿏λ结构顶⾯图和注射位置⽰意

预期结果

⼀个成功的AAV体内转导结果如图5所⽰。

图5 ⼩⿏使⽤以上的⽅法注射EGFP荧光AAV9， 剂量1x1013 GC/kg。注射后第⼗天，分离脑部进⾏分析。海⻢区域图像使⽤ 荧光共聚焦显微镜拍摄。绿⾊：EGFP。蓝⾊： DAPI。

推荐的⼩⿏注射剂量

为成功转导超纯化AAV到⼩⿏组织，以下表格提供了针对不同注射⽅法的建议注射体积和剂量。

注射位点建议体积建议剂量
侧脑室（Lateral ventricles）5 ul1010 GC
伏隔核（nucleus accumben）0.05~0.1 ul107~108 GC
腹侧被盖区（Ventral tegmental area）
海⻢（Hippocampus）
颈静脉（Jugular vein）≥100~250 ul1011 GC
⿏尾静脉（Tail vein）100~250 ul1011 GC
肺（Lung）10 ul/注射位点, 总共5个位点1012 GC
腹腔（Abdominal cavity）200~250 ul>1011 GC
玻璃体（Vitreous humor）1~2 ul5x109 GC
⼼脏（Heart）1.5~3 ul/注射位点, 总共5个位点2.5x109~2.5x1011 GC
肌⾁（Muscle）10 ul/注射位点, 总共4个位点1012 GC

注意：AAV的在组织中的转导效果可以持续2-6个⽉ ，并且通常在注射后2-4周可以达到表达峰值。但是除了注射剂量，其他因素可能也会影响AAV转导后的基因表达时⻓和峰值表达时间。