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载体指南

哺乳动物piggyBac诱导表达载体 (Tet-On)

概述

PiggyBac诱导型基因表达载体结合了载体家高效的PiggyBac载体系统和Tet-On基因诱导表达系统,帮助您在宿主基因组上永久整合可使用四环素诱导表达的GOI表达盒。

Tet-On基因诱导表达载体系统是在哺乳动物细胞中进行实时GOI表达的强大工具。我们的Tet-On基因诱导表达载体系统在无四环素及其类似物(多西环素)的情况下可以做到GOI几近完全沉默并且在加入四环素及其类似物(多西环素)的情况下快速响应实现GOI表达。这是通过tTS和rtTA蛋白响应四环素及其类似物(多西环素)的基因调控功能实现的。当不存在四环素及其类似物(多西环素)的情况下,目的基因几乎或完全沉默;当往体系中添加四环素或其他类似物(多西环素)时,目的基因得到快速高水平表达。四环素不存在的情况下时,衍生于TeR(Tet抑制蛋白)和KRAB-AB(Kid-1蛋白转录抑制结构域)的融合蛋白tTS结合TRE启动子,导致基因转录抑制。另一方面,四环素存在时,衍生于突变型Ter抑制蛋白和VP16蛋白(转录激活结构域)的融合蛋白rtTA结合TRE启动子,激活基因转录。

我们的piggyBac基因诱导表达系统包含两个载体,一个载体被称为辅助质粒,负责编码转座酶;另一个载体被称为转座子质粒,包含两个末端重复序列(TR)以及两者之间的被转座区域。被转座区域中的四环素基因诱导表达盒含有一个可驱动用户选择的GOI表达的四环素响应因子(TRE)启动子,以及驱动调控蛋白tTS/rtTA表达的广泛启动子或者组织特异性启动子。

当辅助质粒和转座子质粒共转染靶细胞时,辅助质粒产生的转座酶将会识别转座子的两个TR元件,然后将被转座区和两个TR元件插入到宿主基因组中。转座插入通常发生在包含TTAA序列的宿主染色体位点,并在转座子两侧出现TTAA重复序列。

PiggyBac属于II类转座子,通过“剪切—粘贴”的机制移动,从一个地方转座到另一个地方,而不留下序列本身(恰好相反,I类转座子是通过“复制—粘贴”的方式移动)。由于辅助质粒是通过瞬时转染进入宿主细胞的,故会逐渐丢失。随着辅助质粒的丢失,转座子在宿主基因组中变成了永久整合。当这些宿主细胞再次被辅助质粒转染,整合的转座子会再次通过“剪切—粘贴”的机制移动。

关于piggyBac基因表达载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Mol Cell Biochem. 354:301 (2011) Review on the piggyBac system
Cell. 122:473 (2005) Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice
Science. 268:1766-9 (1995) Development of rtTA.
J Gene Med. 1:4-12 (1999) Development of tTS.
亮点

我们的Tet-On诱导型基因表达载体旨在—当缺乏四环素时,实现目的基因的几乎或完全沉默;当往体系中添加四环素时,目的基因得到快速高水平表达。我们的piggyBac诱导表达载体系统以及其辅助质粒已经过优化,其在大肠杆菌中具有高拷贝复制能力,且对细胞具有高效转染率。

优势

类似开关的严格基因表达调控:只依赖rtTA的Tet-on系统在没有诱导剂的情况下,会有明显的泄露表达。我们的Tet-On基因表达载体可严格调控基因的表达,在没有诱导剂的情况下可将背景泄露表达最小化,并保持该系统对四环素诱导的高灵敏度。

外源基因的永久整合:常规质粒转染只能实现外源基因的瞬时表达,这种外源基因会随着宿主细胞的分裂而不断丢失,在快速分裂的细胞中显得尤为显著。相反,将PiggyBac转座子载体和辅助质粒一起转染到哺乳动物细胞中,由于转座子在转座酶的作用下,目的基因能稳定地整合到宿主细胞的染色体中,从而实现转座子载体上携带的目的基因在宿主细胞中永久表达。

技术简单:常规转染即可把质粒转入细胞,相比起病毒载体需要进行病毒包装,过程更简单。

载体容量非常大:我们的载体总容量可达30 kb,其中质粒骨架和Tet-On元件只占4.6 kb,有足够大的容量可以放置客户所感兴趣的序列。

不足之处

转染细胞类型受限:PiggyBac载体进入细胞依赖于转染。不同类型的细胞,其转染效率差异非常大。非分裂细胞通常比分裂细胞更难转染,原代细胞比永生化细胞更难转染,一些重要的细胞类型转染难度更大,如神经元和胰岛β细胞。另外,质粒转染主要局限于体外应用,很少应用于体内实验(但可以应用于转基因动物模型制备)。以上因素在一定程度上制约了PiggyBac系统的应用。

载体关键元件

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. When a DNA sequence is flanked by two ITRs, the piggyBac transpose can recognize them, and insert the flanked region including the two ITRs into the host genome. 

TRE promoter: Tetracycline-responsive element promoter (2nd generation). This element can be regulated by a class of transcription factors (e.g. tTA, rtTA and tTS) whose activities are dependent on tetracycline or its analogs (e.g. doxycycline).

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

rBG pA: Rabbit beta-globin polyadenylation signal. It facilitates transcription termination of the upstream ORF.

Promoter: The promoter chosen to drive expression of the tTS/rtTA cassette.

tTS: Tetracycline-controlled transcriptional silencer. This protein binds to TRE promoter to actively suppress gene transcription only in the absence of tetracycline and its analogs (e.g. doxycycline).

T2A: Self-cleaving 2A peptide from thosea asigna virus that allows multiple proteins to be made from a polycistronic transcript containing multiple ORFs separated by T2A. The cleavage occurs through a putative “ribosomal skipping” mechanism.

rtTA: Reverse tetracycline responsive transcriptional activator M2 (2nd generation). This protein binds to TRE promoter to activate gene transcription only in the presence of tetracycline or its analogs (e.g. doxycycline). It has higher sensitivity to the inducing drug and lower leaky activity in the absence of the drug compared to its predecessor.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the tTS/rtTA cassette.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.