mRNA基因递送解决方案

体外转录（IVT）载体设计和克隆

• 我们使用的IVT载体骨架经过优化，具有很高的体外转录效率（图1）。
• 可采用多种经过内部性能验证的5'、3' UTR 和poly(A)尾巴（110 nt）。
• 快速生产可进行下游线性化、加帽、多聚腺苷酸化的定制的 IVT 载体。
• 提供基于文献报道、计算机预测以及实验验证等多种密码子优化服务。

图1 体外转录载体图谱

体外mRNA合成与脂质纳米粒（LNP）封装

• 使用T7 RNA聚合酶合成长达10,000 nt的传统或者自扩增mRNA，产量覆盖ug到mg级别。
• 5' Cap 1加帽、3' poly(A)加尾（110 nt，基于模板序列）加强mRNA稳定性和翻译效率。
• 可引入修饰的核苷，如N1-甲基假尿苷（m1ψ）和5-甲基胞苷（m5C），可增强mRNA翻译效率和免疫逃避性能。
• 多种RNA纯化方式，包括磁珠法和色谱法。
• 可包封mg级别的高质量mRNA-LNP复合物。
• 全面的质量控制方案和LNP质量检测。
• 可针对mRNA大规模制备提供放大工艺开发。

体内与体外验证mRNA基因递送效果

• 凭借我们的高通量克隆以及测试平台，我们使用实验导向的策略优化mRNA UTR、编码序列以及生产方法。
• 我们已搭建功能性验证平台，用于抗原呈递、抗体表达、CAR表达以及CRISPR等应用。
• 我们提供临床导向的CRO服务用于验证mRNA-LNP复合物的递送效率和安全性。使用的动物模型包括啮齿类和非人灵长类。

mRNA疗法的优势

数十年来，使用信使RNA（mRNA）在人体中表达治疗性蛋白质的想法已经在动物模型中得到了大量的测试。得益于持续地对mRNA生物学的深入研究，以及mRNA体外转录（In vitro transcription，IVT）技术和脂质纳米颗粒（Lipid nanoparticle，LNP）技术的最新进展，mRNA疗法的一些技术障碍已经得到解决，并促使当前的SARS-CoV-2 mRNA疫苗的开发生产进入快车道。与其他生物制剂相比，mRNA具有其独特的优点，无论是作为药物本身抑或用于药物开发均有广阔的前景。

首先，与重组蛋白药物相比，LNP包封的mRNA可以有效地穿过细胞膜进行基因递送，并在靶细胞中迅速转化为治疗性蛋白。由于细胞膜自身的抗渗性以及蛋白质自身的电荷和分子量等属性，穿过细胞膜向细胞内递送治疗性蛋白通常是具有相当挑战性的。大多数的外源蛋白在进入细胞后，会进入核内体并被蛋白酶降解。为了成功将蛋白质递送至细胞质，通常需要对蛋白质进行工程改造，以方便穿过细胞膜并规避细胞对其添加额外修饰，避免进入核内体。而mRNA递送系统则没有上述问题，这是因为LNP可以与细胞膜融合，封装的mRNA将被释放至细胞质中。此外，通过引入功能性LNP和优化的UTR序列，则可以更进一步实现mRNA的体内靶向递送。其次，与其它许多将外源DNA永久留在细胞核或者整合至宿主基因组的病毒载体不同，宿主细胞内的外源mRNA在短期内就会被降解，不会改变宿主基因组。使用病毒载体的疫苗是具有诱导插入突变风险的，如果突变发生在宿主基因组的重要的调节或编码区，则可能对细胞产生有害影响。第三，与病毒载体相比，mRNA的生产更具成本效益且更容易扩大规模。由于mRNA体外转录发生在无细胞系统中，因此来源于细胞的杂质和污染不再是问题，此外，工艺开发和大规模生产的标准化变得更加容易。总而言之，mRNA-LNP正在成为疫苗开发、蛋白质替代品、基因组编辑等应用的强力基因递送载体候选，云舟生物可为其设计、生产和优化提供必要的服务。

mRNA生产和质量检测

图2 mRNA合成和LNP封装的典型流程

如图 2 所示，我们典型的mRNA生产流程从设计和合成DNA模板序列开始。模板序列将综合密码子偏好性、GC含量和RNA二级结构的热力学稳定性等情况进行设计，然后将其克隆到体外转录载体中。我们然后对质粒DNA进行纯化、验证和线性化，然后进行体外转录反应，从而产生所需的转录本。修饰的核苷酸，如 m1Ψ和m5C，也可以掺入到体外转录反应中，从而改善 mRNA 的体内翻译效率并降低其免疫原性。我们可使用共转录或酶促反应方法实现高效mRNA加帽（>95%），然后使用mRNA捕获磁珠作为默认的纯化方式，或者根据需求使用寡dT层析色谱纯化mRNA。我们将根据您的实际项目需要，从下表中的QC项目中选择适用的检测项进行mRNA的完整性和纯度进行分析。接下来，mRNA可以进一步在微流体混合器中的进行LNP封装，若有需求也可以使用下表中的方法分析包封效率和纳米颗粒参数。

试验验证

图3和图4对IVT mRNA表达萤光素酶报告基因和EGFP分别进行了体外和体内的功能性测试。

图3 在293T和HeLa细胞中的萤光素酶mRNA和EGFP mRNA的表达效果。使用的mRNA包括无修饰的、N1-甲基假尿苷（N1-methylpseudouridine，m1Ψ）修饰的、以及5-甲基胞苷（5-methylcytidine，m5C）修饰的。细胞生长于12孔板，每孔转染1 ug mRNA。（A）293T细胞转染萤光素酶mRNA后6 h、24 h、48 h的萤光素酶活性。误差线表示标准偏差。EGFP mRNA在293T细胞（B）和HeLa细胞（C）中的转染效果，转染后24 h、48 h以及72 h使用流式细胞术检测。平均荧光强度使用带颜色的柱状图表示，EGFP阳性细胞比例使用圆圈、方块和三角形表示。误差线表示标准偏差。（D）使用荧光显微镜（100x）观察转染EGFP mRNA后72 h的293T和HeLa细胞。

图4 小鼠转导萤光素酶mRNA（Luc mRNA），检测mRNA表达情况和免疫反应。（A）注射后6 h、24 h、和48 h通过活体成像检测萤光素酶活性。（B）为量化外源RNA在小鼠中引发的炎症反应，注射后48小时检测小鼠血清中两种促炎细胞因子IL-6和TNF-α的浓度。误差线表示标准偏差。小鼠种系：C57BL/6J；小鼠年龄：8周；注射方法：肌肉注射。（C）向Balb/C小鼠注射30 ug的LNP包封的mRNA，注射后14天，分离Balb/C小鼠的脾脏细胞，针对病毒抗原A、病毒抗原B以及PBS对照进行IFN-γ ELISpot试验。