RNA已成为可用于诸如RNA疫苗、CRISPR基因组编辑，以及包含CAR-T在内的T细胞疗法等多种治疗应用的极具潜力的治疗方法。VectorBuilder可提供全方位的端到端RNA平台，支持从体外转录（IVT）载体设计到功能验证，再到GMP生产的每一个阶段，助力您的RNA开发从概念走向临床。
优化IVT RNA载体的设计对于开发治疗性RNA开发的相当重要。基于优良载体标准（Good Vector Practice）与我们丰富的RNA工程经验，我们在设计之初便会充分考虑影响表达、稳定性及效力等一系列关键质量因素，确保每种RNA疗法从源头即具备实现最佳性能的良好条件。
我们可为不同类型的研究应用提供多种形式的RNA，包括mRNA、saRNA、circRNA以及其它类型的小RNA。我们的技术团队可帮助您选择合适的IVT骨架，并优化诸如编码序列、5’/3’非翻译区（UTR）、polyA尾、以及Kozak等关键的RNA组件。
VectorBuilder开发了一系列专有技术和试剂，简化了IVT RNA生产流程，并拥有全方位的可满足不同项目规模以及临床阶段的需求的规模化生产平台。为了从最早阶段即将治疗效力作为优先考量，我们提供一系列加帽方式、核苷修饰以及高效的专有纯化策略，可提升体内表达水平并最大程度地降低免疫原性。我们同时也提供适用于大规模RNA生产的无细胞或无动物源体系的生产方式。
脂质纳米颗粒（LNP）对RNA治疗药物的效果至关重要，它能维持RNA稳定性并有助实现高效的细胞递送。VectorBuilder在生产高均一性、高封装效率的LNP方面具有特别优势。我们专注于LNP表层工艺，比如LNP配方优化、添加偶联的组织特异性抗体等，以提升RNA治疗药物的组织特异性和治疗效果。
为确保RNA药物递送过程中具有高度一致的质量与效果，必须依靠严格且设计合理的质量控制体系。诸如RNA完整性、无菌性以及纯度（如内毒素和dsRNA残留）是临床前及临床应用中最关键的质量属性。在VectorBuilder，我们可为IIVT RNA、LNP封装的RNA以及质粒提供全面且可定制的QC解决方案，确保您的产品的可靠性、安全性和效力。
为帮助您将RNA开发从概念到应用的高效推进，我们的专家团队可协助开展功能验证研究，在体外及体内评估RNA治疗药物的效率、疗效及安全性，覆盖CRISPR、CAR表达、癌症治疗等多种应用场景。对于体内验证，可在多种动物模型中进行研究，包括使用啮齿类动物和非人灵长类动物（NHP）。
CRISPR基因组编辑CRISPR IVT RNA基因组具有一系列优点，包括可以不依赖启动子进行跨细胞类型编辑、无基因组整合风险、以及瞬时表达有助于最大限度减少脱靶效应等，使其成为当前用于基因组编辑的热门方法。此外，Cas9 mRNA和gRNA可共同封装于LNP中，与传统载体系统相比，可实现体外和体内更高效的基因递送和编辑。
了解更多关于我们经过充分验证的科研级现货CRISPR RNA产品。
凭借VectorBuilder在载体设计与工程改造方面丰富的专业知识，我们开发了经过序列优化的HiExpress™ hSpCas9和腺嘌呤碱基编辑器（ABE）RNA产品，可显著提升靶蛋白的表达量以及基因组编辑效率。
图1 VectorBuilder开发的HiExpress™ hSpCas9 IVT mRNA具有很高的表达和编辑效率。使用1 ug hSpCas9 IVT mRNA和经过密码子优化的HiExpress™ hSpCas9 IVT mRNA分别转染HEK293T细胞。转染后24 h，对以上两组实验组与非处理对照（NC）进行（A）Western blot分析，并对（B）Cas9相对表达水平进行标准化定量。（C）使用1,000 ng gRNA与指示剂量的hSpCas9 IVT mRNA、HiExpress™ hSpCas9 IVT mRNA分别共转染HEK293T细胞。转染后24 h，T7E1酶切法检测基因编辑效率。蓝色星号所指为完整的PCR扩增子，粉色箭头指所指为T7E1酶切产生的片段。
图2 VectorBuilder HiExpress™ ABE mRNA表现出在体外卓越的腺嘌呤碱基编辑器（ABE） 编辑效率。编码（A）ABE8.20-m和（B） ABE7.10 的mRNA分别与同一个gRNA共转染HEK293T细胞。转染后48 h提取细胞基因组DNA，PCR扩增靶位点区域，然后进行NGS分析。从碱基A到G的变化（星号）可在编辑窗口（虚线框）中检测到。第五个核苷酸分别取得了97.7%（A）和95.6%（B）的最高编辑效率。
图3 VectorBuilder CRISPR RNA解决方案的体内基因敲除。（A）CRISPR IVT RNA的体内基因敲除的实验时间线。使用3.0 ug/g LNP封装的Cas9 mRNA/gRNA混合物、PBS分别静脉注射小鼠。注射后第7天分离肝脏，提取基因组DNA进行PCR扩增，T7E1酶切法验证基因编辑效果。（B）T7E1酶切产物的凝胶电泳结果确认基因编辑发生（星号位置的条带）。每条泳道代表一个生物学重复。
图4 CRISPR介导的体外单gRNA基因敲除。（A）向HEK293T-EGFP细胞转染IVT Cas9 mRNA以及打靶EGFP的两种gRNA。显微镜观察无转染的（NC）以及转染的两组细胞（B）并使用流式细胞术定量检测荧光强度（C和D）。（E和F）基因编辑效果通过T7E1酶切和Sanger测序确认。
图5 CRISPR介导的体外双gRNA基因敲除。（A）编码Cas9的载体经过线性化并经过体外转录，产生Cas9 mRNA。该Cas9 mRNA与一对靶向同个基因的gRNA共转染NIH/3T3细胞。（B）双gRNA打靶目的基因2-4号外显子的实验设计细节。用于PCR验证编辑效果的P1和P2引物经过设计可以扩增靶位点附近的序列。（C）凝胶电泳验证PCR扩增的基因组DNA确认基因编辑发生。
mRNA疫苗mRNA可被快速灵活地设计成疫苗，用于对抗传染病、癌症及新兴病原体，目前已成为疫苗开发的强大平台。与传统蛋白/肽疫苗需依赖细胞培养技术制备抗原不同，mRNA疫苗的生产过程更快速且经济高效。mRNA疫苗可在体内指导细胞产生抗原，从而引发强烈且广泛的免疫反应。这种原理对于复合物类型的药物靶点来说尤其具有价值，而这些靶点分子通常难以用于生产纯化的蛋白，比如结合于质膜表面的病毒糖蛋白、多亚基复合物以及肿瘤新抗原等。此外，LNP技术的进步也进一步提升了疫苗性能，从而可实现稳定、高效且具备靶向特性的RNA递送。VectorBuilder的LNP-RNA平台支持完整开发流程，提供经优化的RNA设计、生产及封装方案，助力高效且有效的mRNA疫苗开发。
图6 使用VectorBuilder的LNP-mRNA构建的CAR-T细胞对CD19+细胞表现出细胞毒性。（A）用LNP封装anti-CD19 CAR mRNA转染人原代T细胞。通过与CD19+ Raji细胞共孵育并检测释放的乳酸脱氢酶（LDH）来验证CAR-T细胞的杀伤功能。（B）两种均被封装于LNP中的编码anti-CD19 CAR的IVT mRNA，分别带有不同共刺激结构域：4-1BB（CD19-BBz，1949 nt）和CD28（CD19-28z，1931 nt）。（C）用相应LNP-mRNA进行转染活化的人原代T细胞，并验证CD19 CAR的表达。 （D）在不同效应细胞:靶细胞（E:T）比例下，将CAR-T细胞与Raji细胞共孵育18小时后，通过LDH检测法测量由T细胞触发的细胞毒性。
图7 经过优化的LNP配方显著提高在人原代T细胞中的RNA转染效率。（A）用LNP封装的EGFP mRNA转染活化的T细胞（每1×10⁶个细胞使用6 μg mRNA）。（B）变性琼脂糖凝胶电泳确认EGFP mRNA在封装前的正确长度和完整性。（C）转染T细胞前测量LNP的粒径和Zeta电位。（D）转染后24小时，通过荧光显微镜和流式细胞术成像并分析EGFP表达情况。
Figure 8. In vivo expression of luciferase (Luc) and antigens using LNP-encapsulated mRNAs. (A) Luciferase activity visualized by live imaging at 6 h, 24 h, and 48 h post-injection. (B) Two pro-inflammatory cytokines, IL-6 and TNF-⍺, were quantified in serum at 48 h post-injection. Error bars represent standard errors. Mouse strain: C57BL/6J; mice age: 8 weeks; injection method: intramuscular injection. (C) IFN-γ ELISpot assay of splenocytes derived from BALB/c mice 14 days post intramuscular injection of 30 ug LNP-encapsulated mRNA coding for viral antigen A, viral antigen B, or control PBS.
CAR-T疗法CAR-T疗法利用经过基因工程改造的T细胞表达嵌合抗原受体（CAR）治疗临床并发症，比如癌症和自身免疫性疾病等疾病。当前越来越多的IVT RNA被用作在T细胞中递送和表达CAR受体，无论是通过体外还是体内的方式。IVT RNA具有瞬时表达、生产工艺简便以及免疫原性较低等优势。与某些病毒载体（如慢病毒）相比，RNA不会整合到靶细胞基因组中，因此产生的CAR-T细胞仅具有瞬时活性，可最大限度减少插入突变风险和长期毒性。结合其生产速度快、成本低的特点，RNA尤其适用于早期个性化临床前测试。此外，LNP封装可确保CAR载体的高效靶向递送，使其在体内CAR-T疗法的开发中愈发具有吸引力。
VectorBuilder全方位的LNP-RNA平台可帮助您设计、优化、和验证CAR载体，从概念到应用，加速您的CAR开发进程。
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图9 基于mRNA免疫策略可对复合型的跨膜抗原分子产生强烈的免疫原性。分别将经过全长TargetX蛋白、mRNA Pool 1和mRNA Pool 2免疫的动物的血清与亲本HEK293细胞和TargetX过表达的HEK293细胞共同孵育。流式细胞术定量检测抗体-抗原结合情况。我们的mRNA免疫平台已在包括小鼠、大鼠、家兔和羊驼在内的多个物种中体现出强大的免疫效果。
图10 使用LNP封装的mRNA体内表达萤火虫荧光素酶（Luc）和病毒抗原。（A）注射后6 h、24h、和48 h通过活体成像检测萤光素酶活性。（B）为测量外源RNA在小鼠中引发的炎症反应程度，注射后48小时检测小鼠血清中两种促炎细胞因子IL-6和TNF-α的浓度。误差线表示标准偏差。小鼠种系：C57BL/6J；小鼠年龄：8周；注射方法：肌肉注射。（C）向Balb/C小鼠注射30 ug的LNP封装的mRNA，注射后14天，分离Balb/C小鼠的脾脏细胞，针对病毒抗原A、病毒抗原B以及PBS对照进行IFN-γ ELISpot试验。
CRISPR-Cas9可以通过多种方法递送，包括质粒、重组病毒、gRNA-Cas9 RNP复合物，以及gRNA和Cas9 IVT mRNA的混合物，而这些方法都有各自的优势和局限性。研究人员应选择适合自己实验应用的递送方法，旨在通过最小化脱靶效应和不良效果获得最佳的编辑效率，而IVT RNA正迅速成为其中一种效果良好的基因编辑工具。
质粒的大量制备一般成本较低，并且可以通过技术相对简单的化学转染和电穿孔进行递送。然而，由于这些递送方式的自身特性，使得质粒载体主要限于体外应用。此外，质粒转染的效率在不同细胞类型之间差异很大，且转基因表达依赖于特定细胞类型的启动子活性，而这在某些系统中可能会降低转基因的表达效率。因此，质粒系统倾向配合使用高活性的启动子以确保Cas9的高水平表达，但是这也会增加脱靶效应和质粒DNA随机整合到宿主基因组中的风险。
重组病毒是递送CRISPR-Cas9的另一种常用工具，特别适合难以转染的细胞类型，并且可以创建稳定表达Cas9的细胞系以用于需要导入多个gRNA的实验。然而，该系统同样与质粒递送系统一样存在诸多相同的限制，包括依赖特定细胞类型的启动子，以及由于长期表达Cas9而导致的脱靶效应风险增加。此外，重组病毒也会带来较高的插入突变风险，特别是在逆转录病毒和慢病毒系统中的Cas9基因整合细胞基因组的时候。
通过gRNA-Cas9 RNP复合物递送可以绕过质粒和重组病毒系统的许多限制，同时实现快速编辑，因为不需要进行转录或翻译。然而，由于需要使用电穿孔方式实现高效的递送，这种方法同样主要限于体外应用。通过这种方法进行的基因编辑发生得很快，但随着Cas9在宿主细胞中被降解，编辑效果会迅速减弱，因此常受到可用的Cas9蛋白的类型限制。
与上述方法相比，使用gRNA和Cas9 IVT mRNA的混合物进行递送当前已被认为同样是一种高效的基因编辑方法，具有最小化脱靶效应的优点。该方法中，gRNA和Cas9 IVT mRNA一起被封装在脂质纳米颗粒或化学转染试剂中，使得该系统适用于体外和体内应用，并且无需担心存在整合宿主基因组的风险。此外，由于不需要进行转录，转基因的表达不依赖于特定的细胞类型启动子活性，翻译的发生也相对更快，从而实现快速且高效的基因编辑。与gRNA-Cas9 RNP复合物相比，mRNA形式的Cas9基因具有更长的表达时长，可达成充分的基因编辑效果。然而，mRNA最终也会被降解，编辑仅暂时发生过，从而限制了脱靶效应的影响。
总而言之，通过质粒、重组病毒和gRNA-Cas9 RNP复合物递送CRISPR-Cas9组分的方法均存在较多限制，对它们在许多场景中的应用造成了阻碍。这些方法具有明显的缺点，包括相对有限的编辑效率、较高的脱靶效应风险以及插入突变的潜在风险等。相对地，基于gRNA和Cas9 IVT mRNA混合物的递送方式具有诸多优点和较少的限制，是一种高效的基因编辑方法，应更多地被考虑用于基因编辑实验。
LNP -mRNA、慢病毒和PB转座子载体CAR-T细胞治疗系统的详细对比如下表所示：
| 特性 | LNP-mRNA | 慢病毒 | PB转座子 |
|---|---|---|---|
| 递送途径 | 体外或体内 | 通常体外 | 通常体内 |
| 细胞特异性 | LNP的自身嗜性通常为肝脏；靶向T细胞需要特定配方/配体（比如抗体）用于体外和体内应用。 | 假型化（如VSV -G）可赋予广泛的组织嗜性；体外转导分离的T细胞是常规且高效的方法。 | 通过电穿孔递送至T细胞，经过优化具有较高的效率 |
| 表达时间 | 瞬时性。表达在数小时内开始，持续数天至约1周。重复给药可重复表达。 | 宿主基因组，且稳定长期表达；表达持续数月至数年（在分裂的T细胞中可实现有效永久性表达）。 | 转座酶介导的基因插入可实现稳定的长期基因组整合；其表达模式与病毒整合相似，除非被切除。 |
| 安全性 | 没有插入突变风险 | 基因组整合会导致产生临床应用所关注的插入突变风险 | 通过稳定插入TTAA位点会导致产生临床应用所关注的插入突变风险 |
| 装载容量 | LNP可以递送4-10 k的长度的mRNA。更长的mRNA则会降低稳定性和翻译效率。 | 至多9.2 kb;较大的载体降低滴度和转导效率。 | 非常大的转载容量；可以转载至多约30 kb的DNA。 |
| 免疫原性 |
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| 剂量可控性 |
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细胞包含位于胞质的和内涵体的两类RNA受体，它们在识别外源RNA时将激活免疫反应。修饰核苷酸通常存在于细胞的内源性RNA中。在IVT mRNA中加入某些修饰的核苷酸可降低其免疫原性，改变二级结构，并以序列依赖的方式提高翻译效率和延长半衰期。我们提供了多种类型的修饰核苷酸，包括常用的N1-甲基假尿苷（m1Ψ）和5-甲基胞苷（m5C）。N1-甲基假尿苷和5-甲基胞苷是最早发现的天然来源是 tRNA，然而，它们在 mRNA 中的功能直到最近才得到重视。尿苷和胞苷的这些甲基化衍生物可以在mRNA IVT和翻译中取代它们使用的默认核苷，而不改变传统的Watson-Crick碱基配对。在mRNA治疗中使用它们的一个主要优势是它们能够帮助RNA规避免疫受体的识别，从而减轻不必要的免疫反应，增强转录稳定性和翻译效率。
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