CAR表达MMLV逆转录病毒载体

利用嵌合抗原受体 (Chimeric antigen receptor，CAR) 载体生产可识别肿瘤相关抗原的工程T细胞（也称为CAR T细胞）已成为一种极富前景的癌症治疗工具。在 CAR T细胞免疫疗法中，来自患者（自体）或健康供体（同种异体）的T细胞经过改造表达CAR。CAR受体可以靶向识别肿瘤细胞表面抗原，活化T细胞使其发挥免疫作用来帮助杀伤肿瘤细胞。

CAR受体的结构由四个主要部分组成：（1）一个胞外抗原识别结构域，由已知特异性的抗体单链可变区片段 (Single chain variable fragment，scFv) 组成。 scFv是由抗原特异性的单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区通过一个柔性肽链连接而成，具有促进抗原结合的特性；（2）一个位于胞外的铰链区或间隔区，将scFv与CAR的跨膜结构域连接起来，并为CAR的结构提供灵活性和稳定性；（3）跨膜结构域将 CAR 锚定在质膜上，从而将胞外的铰链区和抗原结合结构域与胞内信号域关联起来，在增强受体表达和稳定性方面起着关键作用；（4）胞内信号域通常源自T细胞受体（TCR）的CD3 zeta 链，并包含免疫受体酪氨酸激活基序（Immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAMs)。抗原结合后，ITAMs被磷酸化并激活下游信号，从而导致T细胞的后续活化。此外，该胞内结构域还可以引入一个或多个与CD3 zeta信号域串联的共刺激域（来源于CD28、CD137等），来改善T细胞增殖效率和活化的持久性。

CAR的结构在过去几年中随着对胞内结构域的修改而不断发展。第一代CAR仅包含一个衍生于CD3 zeta链的信号域，虽然这种CAR可以激活T细胞，但是由于表达此类CAR的T细胞的细胞毒性和增殖能力偏低，它们在体内的抗肿瘤活性并不理想。第二代CAR除了包含一个CD3 zeta信号域，还具有一个胞内的共刺激域，因此表达第二代CAR的T细胞显著改善了其体内增殖能力、扩增能力和活化的持久性。为了进一步优化CAR T细胞的抗肿瘤能力，第三代CAR除了CD3 zeta外，还引入了两个胞内顺式作用的共刺激结构域。随后，通过修饰第二代CAR的胞内结构域继而进行诱导表达或组成型表达细胞因子，开发出了第四代CAR。第五代和最新一代CAR也是从第二代CAR衍生而来，整合了细胞因子受体的胞内结构域。

我们的MMLV逆转录病毒CAR表达载体源自莫洛尼鼠白血病病毒，该病毒是逆转录病毒家族成员，非常适用于由逆转录病毒介导的向T细胞转导CAR表达框。野生型MMLV病毒基因组是线性双正链RNA。

CAR表达MMLV逆转录病毒载体首先在大肠杆菌中进行载体构建，在MMLV逆转录病毒载体的两个长末端重复序列（Long terminal repeats，LTR）之间克隆完整的CAR表达盒（包含scFV结构域、铰链区、跨膜区和胞内CD3 zeta信号源、共刺激域）。随后，该病毒载体构建完成后与辅助质粒一起转染进入包装细胞。在包装细胞中，位于两个LTR之间的DNA片段会被转录成RNA，由辅助质粒表达的病毒蛋白进一步将RNA包装成病毒颗粒。包装后的活病毒将会被释放到上清液中，可以直接收集或进一步浓缩病毒转染靶细胞。

当病毒转导靶细胞时，释放到宿主细胞中的病毒RNA借助逆转录酶逆转录成双链DNA，然后随机整合进宿主细胞的基因组中。在病毒载体克隆的过程中，位于两个LTR的DNA片段和其余的病毒基因组会稳定地整合到靶细胞的基因组中。

通过改造优化，我们的MMLV逆转录病毒载体删除了与病毒包装和转导相关的基因（这些基因由病毒包装过程中使用的辅助质粒携带），因此所产生的MMLV逆转录病毒颗粒是复制缺陷型的，即包装产生的病毒只具有转导靶细胞的能力，而无法在靶细胞中进行大量复制，因而具有很高的生物安全性。

关于该载体系统的更多信息，请参考以下文献。

我们的CAR表达MMLV逆转录病毒载体可进行第二代CAR表达。经过优化后，该载体在大肠杆菌体内具有很高的拷贝数，包装的活病毒具有很高的滴度，对大多数宿主细胞具有高效的转导能力，能有效地把载体整合到靶细胞基因组中，并实现外源基因的高水平表达。

CAR表达盒的稳定整合： 常规质粒转染只能实现CAR的瞬时表达，这种质粒会随着宿主细胞的分裂而不断丢失，在快速分裂的细胞中显得尤为显著。相反，逆转录病毒转导能稳定地将CAR表达盒整合到细胞的染色体中，使其可以长期表达CAR。

装载量大： 野生型MMLV逆转录病毒基因组约8Kb。在我们的载体上，病毒包装和转导所必需的组件约占2.5Kb，剩下约5.5Kb允许插入用户的目的DNA片段。由于我们的载体为仅插入CAR进行了设计优化，因此该载体载量可以满足所有CAR必要原件的表达。

高水平表达： MMLV 5' LTR包含一个广泛表达强启动子可以驱动用户目的CAR序列的高水平表达。

基因拷贝数相对均一： 通常情况下，采用病毒转导的方式可以相对均一地将外源基因转入到靶细胞中，而传统的质粒转染方式则呈现出高度不均一性，导致某些细胞会获得较多的拷贝质粒而某些则会获得较少甚至完全没有。

体内外实验均有效： 我们的MMLV逆转录病毒载体不仅拥有良好的体外细胞转导能力，同样适用于体内活体动物实验。

安全性： 我们的病毒载体系统将病毒包装和转导所需的相关基因由三个辅助质粒分开表达，在进行病毒包装和病毒转导的时候不会产生具有复制能力的病毒颗粒，因而具有非常高的生物安全性。

依赖5’LTR启动子： 该载体中的CAR表达盒的表达依赖于5’ LTR广泛性启动子，而相较于慢病毒载体则允许用户灵活使用他们想要的启动子来驱动CAR的表达。 

病毒滴度中等： 在没有进一步浓缩的情况下，包装逆转录病毒细胞的上清液中，病毒滴度接近10^7TU/ml，比慢病毒载体的滴度要低大约一个数量级。

插入突变风险： γ逆转录病毒载体有插入到基因转录起始位点附近和原癌基因的倾向，这一特性增加了插入突变的可能性，这也是CAR表达逆转录病毒在临床应用中的一个主要问题。 

技术复杂： 使用MMLV逆转录病毒载体时，需要在包装细胞中产生活病毒，然后测定病毒滴度。因此MMLV逆转录病毒转染相对于常规质粒转染，技术难度更高，周期更长。

生产成本高：: 生成GMP级别的逆转录病毒载体比质粒载体的成本要高得多，这也是基于MMLV逆转录病毒的CAR T疗法临床应用发展的主要限制因素。

5' MoMuLV LTR: MMLV retrovirus 5' long terminal repeat. In wildtype MMLV retrovirus, 5' LTR and 3' LTR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome and point in the same direction. Upon viral integration, the 3' LTR sequence is copied onto the 5' LTR. The LTRs carry both promoter and polyadenylation function, such that the 5' LTR acts as a promoter to drive the transcription of the viral genome, while the 3' LTR acts as a polyadenylation signal to terminate the upstream transcript.

Ψ plus pack2: MMLV retrovirus packaging signal required for the packaging of viral RNA into virus.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

CD8-leader: Leader signal peptide of T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain. Directs transport and localization of the protein to the T-cell surface.

scFv: Single chain variable fragment derived from a monoclonal antibody of known specificity. Recognizes cells in an antigen-specific manner.

Hinge: Extracellular hinge region of the CAR. Connects scFv with the transmembrane region providing stability and flexibilty for efficient CAR expression and function; enhances efficiency of tumor recognition; improves expansion of CAR-T cells.

Transmembrane domain: Transmembrane domain of the CAR. Anchors the CAR to the plasma membrane and bridges the extracellular hinge as well as antigen recognition domains with the intracellular signaling region; enhances receptor expression and stability.

Costimulatory domain: Intracellular costimulatory domain of the CAR. Improves overall survival, proliferation, and persistence of activated CAR-T cells.

CD3zeta: Intracellular domain of the T cell receptor-CD3ζ chain. Acts as a stimulatory molecule for activating T cell-mediated immune response.

3' MoMuLV LTR: MMLV retrovirus 3' long terminal repeat. The polyadenylation signal contained in 3' LTR serves to terminate the transcript from the upstream CAR.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.