哺乳动物shRNA表达腺相关病毒载体

概述

我们的腺相关病毒(AAV)shRNA干扰载体系统是一种非常高效的能稳定在体内和体外干扰各种哺乳动物细胞靶基因表达的载体工具。AAV的免疫原性极低,在体内几乎没有致病性,使得AAV成为许多动物研究的理想工具。

AAV重组载体构建完成后与辅助质粒一起转染进入包装细胞。在包装细胞中,位于两个反向重复序列(ITRs)之间的DNA片段与辅助质粒表达的病毒蛋白进一步包装成病毒颗粒。当病毒转导宿主细胞时,两个ITR之间的外源DNA及病毒基因组一起进入细胞,线性双链DNA基因组以游离DNA的形式存在于细胞核中。由人类U6启动子驱动表达的shRNA将会导致靶基因mRNA的降解。

在大多数情况下,可以在生物安全1级(BSL1)设施中处理AAV。AAV是复制缺陷型的、不会引起炎症反应和引发人类疾病。

人们已从自然界中鉴定出许多AAV病毒株,根据病毒表面衣壳蛋白的不同抗原将它们分成不同的血清型。不同血清型的病毒具有不同的组织亲和性(即感染组织特异性)。当我们的AAV载体使用不同的衣壳蛋白包装病毒时,则会赋予病毒不同的血清型。下表列出了不同的AAV血清型及对应的组织亲和性。

血清型 组织亲和性
AAV1 SM, CNS, lung, retina, pancreas, heart, liver
AAV2 SM, CNS, liver, kidney, retina
AAV3 SM
AAV4 CNS, retina, lung, kidney
AAV5 SM, CNS, lung, retina
AAV6 SM, heart, lung, adipose, liver
AAV7 SM, retina, CNS, liver
AAV8 SM, CNS, retina, liver, pancreas, heart, kidney, adipose
AAV9 SM, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, testes, kidney
AAVrh10 SM, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, kidney

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Methods in Enzy. 507:229-54 (2012) Review of AAV virology and uses
Curr Opin Pharmacol. 24:59-67 (2015) AAV use in gene therapy, and serotype differences

亮点

我们的AAV载体是经过优化的,可在大肠杆菌中进行高拷贝复制,是一个包装病毒滴度高,细胞转导效率高,转基因高水平表达的载体系统。该载体可用所有已知衣壳蛋白血清型的辅助质粒进行包装,包装出来的病毒具有非常高的转导效率,且具有极高的生物安全性。

优势

安全性:AAV是可供选择的最安全的病毒载体,它是复制缺陷的,不会引起任何人类疾病。

对宿主基因组造成破坏的风险性低:病毒转导到宿主细胞后,AAV载体以游离DNA的形式存在于细胞核中。AAV对宿主基因组的非整合特性使其减少了对宿主基因组的破坏而致癌的风险,可作为人类体内应用的理想载体。

稳定干扰:AAV通常在核内保持稳定的游离状态,由U6启动子驱动shRNA的组成型表达,对靶基因的干扰通常是稳定且持久的。

病毒滴度高:利用我们的AAV病毒载体可以包装成高滴度的病毒。我们提供的病毒包装服务病毒滴度可达到>1011 GC/ml。

宿主范围广:针对不同来源的常用哺乳动物(如人、小鼠和大鼠)细胞和组织,将我们的AAV载体包装成对其具有亲和性的血清型,可轻易实现高效转导。但是,某些类型的细胞仍然难以转导(见下文不足之处),这与所用的血清型有关。

体内外实验均有效:我们的载体不仅能用于体内活体动物实验,还具有体外细胞转导能力。

不足之处

难以转导特定类型的细胞:当利用合适的血清型进行包装时,我们的AAV载体系统可以转导很多不同类型的细胞,包括非分裂细胞。不同AAV血清型对不同类型的细胞具有不同的亲嗜性,针对某种特定类型的细胞需要特定血清型。

稳定干扰:AAV通常在核内保持稳定的游离状态,由U6启动子驱动shRNA的组成型表达。一旦AAV shRNA干扰载体对基因产生了干扰,目的基因的表达就很难被重新激活。 根据不同的实验目的,这有可能是优势也可能是劣势。

技术复杂:使用AAV病毒载体时,需要在包装细胞中产生活病毒,然后测定病毒滴度。这些过程相对于常规质粒转染,技术难度更高,周期更长。在订购载体的同时,可以通过订购我们的病毒包装服务轻松解决这些问题。

载体关键元件

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wild type virus, 5' ITR and 3' ITR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome pointing in opposite directions, where they serve as the origin of viral genome replication.

U6 Promoter: Drives expression of the shRNA. This is the promoter of the human U6 snRNA gene, an RNA polymerase III promoter which efficiently expresses short RNAs.

Sense, Antisense: These sequences are derived from your target sequences, and are transcribed to form the stem portion of the “hairpin” structure of the shRNA.

Loop: This optimized sequence is transcribed to form the loop portion of the shRNA “hairpin” structure.

Terminator: Terminates transcription of the shRNA.

hPGK promoter: Human phosphoglycerate kinase 1 gene promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat. See description for 5’ ITR.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.