我应该在多顺反子表达盒中使用IRES还是2A肽（以及哪个2A肽）？

当您希望使用单个启动子驱动多个ORF的表达时，您可以选择将多个ORF置于启动子后面，通过连接子（linkers）如内部核糖体进入位点（IRES）或2A肽将每个ORF分隔开，单个mRNA转录物将会产生多个蛋白。

作用机制

最常用的IRES元件来源于脑心肌炎病毒（EMCV），作为额外的核糖体募集位点起作用，允许翻译起始发生在除了翻译起始位点之外的mRNA内部区域。

2A肽是来源于病毒的短肽（〜18-25个氨基酸），它们通常被称为“自我剪切”肽，能使一条转录产物产生多种蛋白。2A肽并不是完全的“自我剪切”，而是通过使核糖体跳过2A元件C-末端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用，最终导致2A序列末端和下游产物分离。其中，上游蛋白的C端将会添加一些额外的2A残基，而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。目前有四种常用的2A肽，分别是P2A，T2A，E2A和F2A，来源于四种不同的病毒。

两种连接子（linkers）的优缺点

IRES优于2A肽的关键优势在于它不影响上下游ORF的蛋白序列。

IRES的主要缺点是与上游ORF相比，下游ORF的表达水平比较低（通常为上游的10%-20%）。这就是为什么当人们在IRES后表达荧光蛋白时，常常难以获得可检测的荧光信号，特别是在体内应用。此外，IRES元件的大小（>500 bp）也可能会增加载体构建和病毒包装的难度。

2A肽优于IRES的关键优势在于下游ORF的表达水平与上游ORF相当（或者略小于）。

2A肽的缺点可能是会在上下游ORF留下附加残基，从而可能产生不良影响。2A肽的自我切割并不是100％有效的，其效率会受上下游ORF序列的影响。因此，不能进行有效自我切割的融合蛋白将会是一种翻译产物，在某些实验运用中，这是一个值得注意的问题。

如果您的实验不需要第二个ORF的高水平表达（如药物筛选标记），那么IRES应该是可以满足实验要求的。然而，如果多顺反子中存在两个以上的ORF，或者等量共表达多个ORF很重要，我们建议您使用2A肽。

不同2A肽的比较

在四种常用的2A肽（P2A，T2A，E2A和F2A）中，P2A通常具有最高的切割效率（在某些情况下接近100％），接下来是T2A，其次是E2A和F2A。F2A的切割效率仅为约50％，我们通常推荐在多顺反子中使用P2A或T2A。

参考文献

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