服务商工作站 >>
现货Cas9蛋白
VectorBuilder提供的即用型Cas9蛋白，可直接用于基因编辑实验，包括敲除（KO）和敲入，具有高效率且脱靶效应风险更低。此外，如需其他Cas9变体或Cas家族蛋白，可通过我们的重组蛋白生产服务获得。
亮点
- Cas9蛋白从E. coli或昆虫细胞中分离纯化，并为实现高编辑性能进行了优化。
- 无论是直接进行蛋白转染还是用于与您所选的gRNA形成RNP复合物，均具有很高的编辑效率。
- 全面且严格的质量控制，确保高纯度和最佳功能。
订购信息
运输和存储
通过E. coli生产的SpCas9以冻干粉末形式交付，常温运输，若同一订单中包含其他需要使用干冰运输的产品，则会使用干冰进行运输。收到蛋白后，请将产品存放于–20°C至–80°C。复溶及分装操作时请保持无菌，避免反复冻融。在–20°C至–80°C条件下保存，产品可稳定存放长达一年。
通过昆虫细胞生产的SpCas9以液体形式交付，干冰运输。请注意干冰运输可能产生额外费用。若需要具有性价比的选择，可选用常温发货的大肠杆菌来源SpCas9。收货后，请立即分装蛋白，分装操作时请保持无菌，以避免反复冻融。在–20°C至–80°C条件下保存，产品可稳定存放长达一年。
试验验证
实验鉴定
CRISPR介导的基因敲除
CRISPR介导的基因敲入
鉴定由E. coli和昆虫细胞生产的纯化SpCas9蛋白。
- E. coli
- 昆虫细胞
图1 使用E. coli生产的SpCas9纯化蛋白表征。（A）SDS-PAGE分析显示纯化蛋白的分子量约为139.7 kDa（还原条件下），纯度≥95%。（B）SEC-HPLC确认纯度≥95%。（C）体外DNA切割实验评估纯化Cas9蛋白的生物学活性。将760 bp线性DNA模板和gRNA分别与Cas9实验组（+）或无酶的阴性对照组（-）混合。加入Cas9后，底物按预期将被切割为两个DNA片段（450 bp和310 bp）。VectorBuilder的SpCas9对底物的切割效率≥90%。N：阴性对照；VB：VectorBuilder SpCas9（E. coli）。
图2 使用杆状病毒-昆虫系统生产的SpCas9纯化蛋白表征。（A）SDS-PAGE分析显示纯化蛋白的分子量约为139.5 kDa（还原条件下），纯度≥90%。（B）SEC-HPLC确认纯度≥95%。（C）采用体外DNA切割实验评估纯化Cas9蛋白的生物活性。将760 bp线性DNA模板和gRNA分别与Cas9实验组（+）或无酶的阴性对照组（-）混合。加入Cas9后，底物按预期切割为两个DNA片段（450 bp和310 bp）。VectorBuilder的SpCas9对底物的切割效率达到≥90%。N：阴性对照；VB：VectorBuilder SpCas9（昆虫细胞）。
图3 使用gRNA/Cas9核糖核蛋白（RNP）方法，通过双gRNA删除DNA片段，生成纯合的靶基因敲除（KO）突变体。（A）编辑过的RNP复合物通过电转法导入靶细胞后可结合靶基因的两个位点以敲除一段长13 kb的区域，然后分离单克隆细胞并筛选。使用PCR和Sanger测序验证细胞的基因型。（B）在三个PCR反应中，使用了P1-P4四条引物以区分敲除和野生型克隆。（C）PCR结果验证了克隆1中的纯合敲除突变，并进一步在（D）靶基因测序结果中得到印证。.
图4 CRISPR介导的iPSC中的基因敲入。通过电穿孔法将Cas9/gRNA核糖核蛋白复合体及供体载体导入iPSC，成功敲入UBC驱动的EGFP（2432 bp）。（A）通过Sanger测序验证EGFP在靶位点的敲入效果。（B）四个基因敲入纯合体单克隆的基因分型PCR检测。野生型靶位点区域长762 bp，敲入EGFP后靶位点区域长3194 bp。（C）显微镜下观察敲入细胞的EGFP荧光表达。（D）核型分析结果。（E）通过免疫荧光检测EGFP敲入的iPSC中NANOG、OCT4和SOX2等多能性标志物的表达，证实其细胞保持有多能性。
文档
暂无
常见问题解答
Cas9 RNP相较于基于质粒或病毒的递送系统，具有多项重要优势。由于Cas9蛋白和gRNA是以活性形式直接导入细胞，基因编辑可快速发生，无需经过转录或翻译过程。此外，仅递送蛋白和RNA则不存在外源DNA随机插入宿主基因组的风险，同时，由于Cas9蛋白会被宿主细胞快速降解，Cas9脱靶切割的风险也被降到了最低。不仅如此，RNP可以通过电穿孔实现高效递送，因此适用于许多难以通过化学方法完成转染的细胞。这种方法也不依赖细胞类型特异性启动子活性，因此可以在各类细胞中有效发挥作用。
Cas9 RNP的瞬时特性意味着基因编辑会在电穿孔后迅速发生，随后随着复合物在细胞内降解而逐渐减弱。当需要瞬时的Cas9活性时（例如为减少长期脱靶效应），这一特性非常有用。但这也要求实验必须做好精细的时间规划，因为大部分编辑事件会在递送后相对短的时间内发生，而不会像更稳定的Cas9递送系统那样在多天内持续发生编辑。