载体指南
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## 概述 CRISPR/Cas9(规律成簇的间隔短回文重复序列及相关9)核酶表达载体属于几种新兴的基因组编辑工具之(另外两种是ZFN和TALEN),可在基因组的靶位点快速有效地产生突变。这些质粒载体编码的特异性RNA,能够引导DNA核酶(或缺刻酶)编辑基因组中特定位点的DNA序列。 Cas9是RNA引导DNA核酶,是天然原核免疫系统的部分,赋予细菌产生对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抵抗能力。在细胞内,Cas9核酶与引导RNA(gRNA)形成复物,该复物通过与基因组中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用,gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位靶序列上,然后切割基因组中的靶位点。为了方便使用,我们设计的CRISPR/Cas9载体能够在个载体上同时有效表达Cas9核酶(或缺刻酶)和引导RNA(gRNA)。 我们的CRISPR/Cas9表达载体中有两种Cas9核酶供选择,种是标准的人源化Cas9(hCas9),能够有效地在靶位点产生双链断裂(DSBs);另种是"缺刻酶"(Cas9_D10A),仅在DNA中产生单链切割。...
## 概述 FLEX条件性表达腺病毒载体了载体家的高效的腺病毒载体系统和Cre响应的FLEX条件性基因表达载体,可以帮助您实现在多种多的哺乳动物细胞中以腺病毒转导Cre响应的FLEX基因表达调控开关。FLEX Cre-Switch系统的两个Lox- 变体重组位点之间包含对反向平行的ORF,在Cre重组酶的调控下ORF上的两个目的基因编码方向反转,从而让个目的基因从激活表达变成沉默,另个目的基因从沉默变成激活表达。 FLEX Cre-switch系统由两对异型Lox-变体重组位点组成,其中野生型序列称为LoxP,突变体称为Lox2272,分别位于两个基因ORF的两侧。 两个ORF相互反向,其中个ORF具有正确的读码方向(相对于启动子)。两种Lox-变体都可被Cre识别,但只有相同的Lox位点对可以彼此重组,与其他Lox- 变体不能进行重组。LoxP和Lox2272位点以交替方式位于两个ORF两端,每对位点互为反向。Cre重组酶不存在的情况时,第个ORF由于其编码方向与启动子方向相同,可以在客户定制的启动子驱动下正常表达,而第二个ORF由于其方向相反则无法正常表达。...
该系统利用细菌根瘤农杆菌杆菌将外源DNA整多种植物细胞基因组。 农杆菌双元载体系统来源于天然肿瘤诱导(Ti)质粒,农杆菌将Ti-质粒中的转移DNA(T-DNA)区域整植物宿主基因组中。T-DNA位于两个25 bp的T-DNA边界重复序列之间,且两个T-DNA边界重复序列方向相同。在我们的双元载体系统中,所有与肿瘤形成相关的序列都被去除,仅留下T- DNA边界重复序列,两个T-DNA边界重复序列中间的目的序列将整宿主基因组中。 完整的双元载体系统由两部分组成。第种被称为T-DNA双元载体(或简称为"双元载体"),包含两个T-DNA重复序列,用户感兴趣基因将被克隆两个T- DNA重复序列之间。第二种载体称为vir辅助质粒,负责编码将两个T- DNA重复序列之间的区域整植物细胞基因组中所必需的组分。需要通过共转化、共电转或融的方式将这两种质粒起导入根癌土壤杆菌中,然后使用该菌株侵染宿主植株。 当双元载体和vir辅助质粒共存于农杆菌时,由vir辅助质粒编码的反式作用于T-DNA边界重复元件以介导加工,分泌和宿主基因组的整。...
该载体的转座子系统来源于Tc1/mariner转座子超家族,开始是从鱼类基因组分离出来,并且经过了大量的累积突变已失去转座子活性。睡美人转座子通过移除鲑鱼基因组的Tc1/mariner转座子上的这些失活突变,重新构筑出有活性的转座子。该方法成的转座子提供了种在脊椎动物中高效地进行基因转导和插入突变的方法。 睡美人转座子载体系统包含两个组分。个组分是Sleeping beauty转座酶(通常为表达Sleeping beauty转座酶的IVT mRNA)。另个组分则是转座子载体,包含由两个反向/正向重复序列(IR/DR)包围的转座子区域。需要被递至宿主细胞的基因被克隆至该区域。 表达Sleeping beauty转座酶的IVT mRNA和转座子载体共转染至靶细胞时,IVT mRNA表达的转座酶会识别IR/DR序列,然后将两个IR/DR序列之间的区域作为转座子插入宿主基因组上的TA二核位点。 睡美人转座子时II型转座子,这意味着其遵循剪切-粘贴的转座机制,从个地方转移序列至另个地方不会留下多余的基因拷贝(I型转座子则遵循复制- 粘贴机制)。...
## 概述 第次使用显微注射法将DNA递至线虫体内的实验发生在1991年。在这个实验中,常规质粒DNA被注射线虫的远端性腺。注射后的DNA进入性腺细胞细胞核中形成染色体以外的质粒微阵列,并可以遗传代。该种技术存在多种局限:首先,常规质粒形成的微阵列在多个世代后其表达水平可能会不稳定。第二,该方式产生的转基因动物是嵌体,意味着有些细胞成功转染了而另些则没有。 关于该载体系统的更多信息,请参照下列文献。 参考文献 | 主题 ---|--- EMBO J. 10:3959 (1991) | DNA transformation in C. elegans Sci Rep. 9:9192 (2019) | Promoter-proximal introns increases gene expression levels in C. elegans. ## 亮点 我们的载体经过门优化,整了启动子近端的内含子序列在载体骨架上,可以在线虫中高水平表达目的基因。...
## 概述 AAV诱导型基因表达载体了载体家应用广泛的AAV载体系统和Tet-On基因诱导表达系统,帮助您在体内体外都能进行四环素诱导表达实验。 Tet-On基因诱导表达载体系统是在哺乳动物细胞中进行实时GOI表达的强大工具。我们的Tet- On基因诱导表达载体系统在无四环素及其类似物(多西环素)的情况下可以做GOI几近完全沉默并且在加入四环素及其类似物(多西环素)的情况下快速响应实现GOI表达。这是通过tTS和rtTA响应四环素及其类似物(多西环素)的基因调控功能实现的。当不存在四环素及其类似物(如doxycycline)的情况下,目的基因几乎或完全沉默;当往体系中添加四环素或其他类似物(如doxycycline)时,目的基因得快速高水平表达。四环素不存在的情况下时,衍生于TeR(Tet抑制)和KRAB- AB(Kid-1转录抑制构域)的融tTSTRE启动子,导致基因转录抑制。另方面,四环素存在时,衍生于突变型Ter抑制和VP16(转录激活构域)的融rtTATRE启动子,激活基因转录。...
当病毒基因组被逆转录并永久整宿主细胞基因组时,用户定制的启动子会驱动包含目的基因和个或多个基于miR30的靶向目的基因的shRNA(shRNAmiR)多顺反子的表达。 shRNAmiR转录物通过胞内micro-RNA途径加工产生成熟的shRNA,促进靶基因mRNA的降解。 Learn more >> 与常规shRNA载体(利用RNA聚酶III启动子如U6介导shRNA的表达)不同,基于miRNA的shRNA干扰载体系统采用了标准RNA聚酶II启动子,这使得可以运用组织特异性,诱导型或可变强度的启动子进行实验,而组成型U6启动子则无法实现。 RNA聚酶II启动子具有能够有效转录长转录物的能力,相对于其他干扰载体系统拥有许多额外的优势。首先,多个shRNAmiR可以作为单个多顺反子进行转录,在细胞内加工成成熟的shRNA, 这使得单个转录物能同时干扰多个基因或靶向相同基因内的多个区域。...
## 概述 FLEX介导条件性表达腺病毒载体了载体家的高效的腺病毒载体系统和Cre响应的FLEX条件性基因表达载体,可以帮助您实现在多种多的哺乳动物细胞中以腺病毒转导Cre响应的FLEX基因表达调控开关。FLEX Cre-On系统利用位于目的基因两侧的Lox- 变体重组位点,在Cre重组酶的调控下目的基因发生反转,目的基因正常表达;而Cre不存在的情况下,目的基因不表达。 FLEX Cre-On系统由两对异型Lox- 变体重组位点组成,其中野生型序列称为LoxP,突变体称为Lox2272,分别位于反向基因ORF(相对启动子方向而言)的两侧。 两种Lox- 变体都可被Cre识别,但只有相同的Lox位点对可以彼此重组,与其他Lox-变体不能进行重组。 LoxP和Lox2272位点以交替方式位于ORF两端,每对位点互为反向。...
## 概述 FLEX条件性表达腺病毒载体了载体家的高效的腺病毒载体系统和Cre响应的FLEX条件性基因表达载体,可以帮助您实现在多种多的哺乳动物细胞中以腺病毒转导Cre响应的FLEX基因表达调控开关。FLEX Cre-Off系统利用位于目的基因两侧的Lox-变体重组位点,在Cre重组酶的调控下目的基因发生反转,目的基因表达被抑制。 FLEX Cre-off系统由两对异型Lox-变体重组位点组成,其中野生型序列称为LoxP,突变体称为Lox2272,分别位于ORF的两侧。 两种Lox- 变体都可被Cre识别,但只有相同的Lox位点对可以彼此重组,与其他Lox-变体不能进行重组。 LoxP和Lox2272位点以交替方式位于ORF两端,每对位点互为反向。Cre重组酶不存在的情况下,客户定制的启动子可以驱动目的基因的正常表达。Cre重组酶存在的情况下,LoxP和Lox2272位点对分别重组,导致ORF方向反转为反向,且其中的对重组位点将具有相同的方向,Cre会介导产生正向重组切割,继而分别留下个不同的重组位点。ORF方向的反转,使得目的基因无法正常表达。...
## 概述 慢病毒shRNA干扰载体系统是种非常高效的,能稳定干扰各种哺乳动物细胞靶基因表达的载体工具。旦病毒基因组被逆转录成DNA并永久整宿主细胞基因组中,由人类U6启动子驱动表达的shRNA将会导致靶基因mRNA的降解。与成siRNA相比,慢病毒干扰具有明显的优势(见下文载体优势)。 Learn more >> 通过改造优化,我们的慢病毒载体删除了与病毒包装和转导相关的基因(这些基因由辅助质粒进行表达,用于病毒包装过程),使产生的慢病毒颗粒是复制缺陷型的。即包装的病毒只具有转导靶细胞的能力,而无法在靶细胞中进行大量复制,因而具有很高的生物安全性。 更多信息请查阅"慢病毒基因表达载体",关于慢病毒shRNA干扰载体的更多信息,请参考以下文献。 参考文献 | 主题 ---|--- RNA. 9:493-501 (2003) | Development of lentiviral shRNA vectors Show less ## 亮点 我们的慢病毒shRNA干扰载体采用的是第三代慢病毒包装载体系统。...
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