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载体指南

线虫常规质粒基因表达载体

概述

第一次使用显微注射法将DNA递送至线虫体内的实验发生在1991年。在这个实验中,常规质粒DNA被注射到线虫的远端性腺。注射后的DNA进入性腺细胞细胞核的中形成染色体外质粒微阵列,并可以遗传到下一代。该种技术存在多种局限:首先,常规质粒形成的微阵列在多个世代后其表达水平可能会不稳定。第二,该方式产生的转基因动物是嵌合体,意味着有一些细胞成功转染了而另一些则没有。

关于该载体系统的更多信息,请参照下列文献。

参考文献 主题
EMBO J. 10:3959 (1991) DNA transformation in C. elegans
Sci Rep. 9:9192 (2019) Promoter-proximal introns increases gene expression levels in C. elegans.
亮点

我们的载体经过专门优化,整合了启动子近端的内含子序列在载体骨架上,可以在线虫中高水平表达目的基因。

优势

T技术简单:向线虫转染质粒载体是技术上相对直接且对比病毒载体需要包装生产而更为简单的方式。可以使用电转染、显微注射或者喂食包含质粒载体的大肠杆菌等方式将质粒导入线虫体内。

装载量大我们的载体可以容纳总共约30 kb的DNA。该质粒的骨架部分只占约2.25 kb,因此留下了巨大的空间用于插入用户的目的基因。

高表达水平:合成的启动子近端的内含子序列被整合至载体骨架,可以带来很高水平的基因表达。

不足之处

载体DNA无法整合基因组:常规质粒载体主要以游离体DNA的形式存在于细胞中而且通常不整合基因组。如果质粒载体含有抗药性基因的表达盒,那么载体DNA稳定整合细胞基因组可以对转染的细胞进行药筛。

可转染的细胞类型有限:使用常规质粒转染不同的细胞类型的转染效率差异可能很大。

基因递送效果的不均一性:尽管高水平表达的转基因容易实现,但是质粒转染的均一性可能较差。有些细胞携带较多的质粒拷贝,有些则携带较少的拷贝甚至没有。

载体关键元件

Promoter: The promoter driving your gene of interest is placed here.

Synthetic intron: This is placed in proximal to promoter to promote gene expression.

Kozak: Kozak consensus sequence. This is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

3' UTR+polyA: Allows transcription termination and polyadenylation of mRNA transcribed by RNA polymerase II. It functions in somatic and germ cells.

Ampicillin:  Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.