载体指南
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## 概述 PB转座子质粒基因表达系统利用LoxP-Stop- LoxP(LSL)表达盒,在哺乳动物和动物内实现Cre介导的条件性基因激活表达。LSL表达盒包含三个重复的SV40 polyA,序列两为LoxP位点。用户选择的启动子位于LSL表达盒的上,而用户感兴趣的基因位于其下。在Cre重组酶不存在的情况下,该表达盒完全阻断了目的基因的正常表达;当将Cre引入携带该中时,目的基因上的LSL表达盒将会被删除,从而目的基因能够在用户选择的启动子下被永久激活表达。 该不仅适用于,更适用于转基因动物模型的构建。当携带这种的转基因动物与携带组织特异性表达Cre的转基因动物杂交时,产生的动物后代将在特定的中组织特异性表达Cre,从而启动目的基因在该特定中组织特异性表达。 在中使用该系统时,可将抗生素或荧光标记添加到中,使转染后的可被筛选或可示踪以便于分离出已永久整合。...
## 概述 在哺乳动物和动物中,该常规质粒FLEX(Flip-Excision)条件性基因表达系统Cre- on,通过Cre重组酶条件性激活目的基因的表达。FLEX Cre-on系统利用位于目的基因两侧的Lox- 变重组位点,在Cre重组酶的调控下目的基因发生反转,目的基因正常表达;而Cre不存在的情况下,目的基因不表达。 FLEX Cre-on系统由两对异型Lox- 变重组位点组成,其中野生型序列称为LoxP,突变称为Lox2272,分别位于反向基因ORF(相对启动子方向而言)的两侧。 两种Lox- 变都可被Cre识别,但只有相同的Lox位点对可以彼此重组,与其他Lox-变不能进行重组。 LoxP和Lox2272位点以交替方式位于ORF两,每对位点互为反向。Cre重组酶不存在的情况时,目的基因由于其编码方向与启动子方向相反,所以不发生表达; 在Cre的存在下,LoxP和Lox2272位点对分别重组,导致ORF方向反转为正向,且其中的一对重组位点将具有相同的方向,Cre会介导产生正向重组切割,继而分别留下一个不同的重组位点。...
## 概述 在哺乳动物和动物中,该常规质粒FLEX(Flip-Excision)条件性基因表达系统Cre- off,通过Cre重组酶条件性失活目的基因的表达。FLEX Cre-off系统利用位于目的基因两侧的Lox- 变重组位点,在Cre重组酶的调控下目的基因发生反转,目的基因不能正常表达;而Cre不存在的情况下,目的基因则正常表达。 FLEX Cre-off系统由两对异型Lox-变重组位点组成,其中野生型序列称为LoxP,突变称为Lox2272,分别位于ORF的两侧。 两种Lox- 变都可被Cre识别,但只有相同的Lox位点对可以彼此重组,与其他Lox-变不能进行重组。 LoxP和Lox2272位点以交替方式位于ORF两,每对位点互为反向。Cre重组酶不存在的情况下,客户定制的启动子可以驱动目的基因的正常表达。Cre重组酶存在的情况下,LoxP和Lox2272位点对分别重组,导致ORF方向反转为反向,且其中的一对重组位点将具有相同的方向,Cre会介导产生正向重组切割,继而分别留下一个不同的重组位点。ORF方向的反转,使得目的基因无法正常表达。...
## 概述 利用嵌合抗原受 (Chimeric antigen receptor,CAR) 生产可识别肿瘤相关抗原的工程T(也称为CAR- T)已成为一种极富前景的癌症治疗工具。在 CAR- T免疫疗法中,来自患者(自)或健康供(同种异)的T经过改造表达CAR。CAR受可以靶向识别肿瘤表面抗原,活化T使其发挥免疫作用以帮助杀伤肿瘤。 CAR受的结构由四个主要部分组成:(1)一个外抗原识别结构域,由已知特异性的抗的单链可变区片段 (Single chain variable fragment,scFv) 组成。 scFv促进抗原结合,包含一个轻链可变区片段和一个特异的单克隆抗的重链片段,两者通过一个柔性的肽链相连;(2)一个位于外的铰链区或间隔区,将scFv与CAR的跨膜结构域连接起来,并为CAR的结构提供灵活性和稳定性;(3)跨膜结构域,将CAR锚定在质膜上,从而将外的铰链区和抗原结合结构域同内结构域关联起来。...
## 概述 CRISPR/Cas9(成簇规则间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9)系统极大地促进了多种物种的外和内基因抑制实验。在内,Cas9核酸酶与引导RNA(gRNA)形成复合物,该复合物通过与基因组中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用提供靶向特异性。gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上,然后切割基因组中的靶位点。Cas9扫描基因组并切割与gRNA互补的序列,前提是这些序列跟随着一段NGG前间区序列邻近基序(PAM)。双链DNA断裂随后被HDR或者NHEJ途径修复,从而产生不同大小长度的位点突变(碱基插入或缺失)。 使用一个一化的同时表达Cas9和gRNA的,或者分开表达Cas9和gRNA的,可以方便地在线虫中进行CRISPR/Cas9编辑。该系统属于后者,包含一个线虫密码子优化的U6启动子驱动表达的gRNA。该可以被注射到线虫的远性腺,然后进入生殖核。使用该注射的线虫可以表达Cas9。筛选突变后代,获得突变可遗传的基因敲除线虫品系。 关于该系统的更新信息,请参考以下文献。...
## 概述 杆状病毒系统广泛应用于昆虫中表达重组蛋白,它是真核表达重组蛋白最通用和最强大的系统之一。该系统特别有利于在真核宿主中大规模制备重组蛋白。许多真核生物蛋白的翻译后修饰只能在真核中发生(例如糖基化),或者需要真核环境来进行正确折叠(例如膜蛋白质),而原核蛋白表达系统却没有这些功能。 杆状病毒是一种双链DNA病毒,通常会感染昆虫,特别是鳞翅目昆虫(moths, butterflies and skippers)。我们的克隆pBV是经优化的,可与来自AcMNPV(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus)的穿梭(称为Bacmid)一起使用,该穿梭的野生型基因组大小为134 kb。 首先将目的基因克隆到含有强启动子的pBV上,目的基因表达盒与庆大霉素抗性基因的侧翼序列为Tn7转座子末元件Tn7L和Tn7R。然后,将该转化到携带Bacmid穿梭和辅助质粒的大肠杆菌中。...
## 概述 在哺乳动物和动物中,该常规质粒FLEX(Flip-Excision)条件性基因表达系统Cre- switch,通过Cre重组酶条件性控制两个ORF的表达。FLEX Cre-switch系统利用位于两个平行反向ORF两侧的Lox- 变重组位点,在Cre重组酶的调控下失活一个目的基因的表达,而激活另一个目的基因表达。 FLEX Cre-switch系统由两对异型Lox-变重组位点组成,其中野生型序列称为LoxP,突变称为Lox2272,分别位于两个基因ORF的两侧。 两个ORF相互反向,其中一个ORF具有正确的读码方向(相对于启动子)。两种Lox-变都可被Cre识别,但只有相同的Lox位点对可以彼此重组,与其他Lox- 变不能进行重组。LoxP和Lox2272位点以交替方式位于两个ORF两,每对位点互为反向。Cre重组酶不存在的情况时,第一个ORF由于其编码方向与启动子方向相同,可以在客户定制的启动子驱动下正常表达,而第二个ORF由于其方向相反则无法正常表达。...
## 概述 通俗名称: scAAV shRNA干扰,scAAV shRNA knockdown vector VB系统名称: 哺乳动物shRNA干扰scAAV,mammalian shRNA knockdown scAAV vector 我们的scAAV(self-complementary adeno-associated virus,中文名为双链腺相关病毒或者自我互补腺相关病毒)shRNA干扰系统是一种有效敲低哺乳动物蛋白基因表达水平的工具,可用于、动物内实验。 scAAV 是基于ssAAV(adeno-associated virus,中文名为腺相关病毒,简称AAV或者ssAAV)改造而成的一种病毒基因组是自我互补型双链DNA的AAV。由于野生型的AAV的病毒基因组是single- stranded DNA,与scAAV区分时,往往写成ssAAV。...
## 概述 常规非编码RNA表达质粒是在多种哺乳动物中转染和表达非编码RNA的高效工具。非编码RNA是一类长度小于30个核苷酸或者大于200个核苷酸的功能性RNA,包括:小分子RNA(micro RNA, miRNA)、小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)、Piwi蛋白互作RNA(piwi-interacting RNA, piRNA),小核RNA(small nuclear RNA, snRNA)、核仁小RNA(small nucleolar RNA, snoRNA)、基因间长链非编码RNA (large intergenic non-coding RNA, lincRNA)、内含子长链非编码RNA(intronic long non-coding RNA, intronic lncRNA)、天然反义转录物(natural antisense transcripts, NAT)、增强子RNA(enhancer RNA , eRNA)和启动子相关RNA(promoter-associated RNA , PAR)等。...
## 概述 CRISPR/Cas9核酸酶表达是当前几种流行的基因编辑工具之一,可以快速有效地在基因组靶序列上创造突变(其它两种常见的工具是ZFN和TALEN)。 Cas9是RNA引导DNA核酸酶,是天然原核免疫系统的一部分,赋予菌产生对质粒和噬菌等外源遗传物质的抵抗能力。在内,Cas9核酸酶与引导RNA(gRNA)形成复合物,该复合物通过与基因组中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用,gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上,然后切割基因组中的靶位点。 使用CRISPR打靶目的基因需要目标同时表达Cas9和特异gRNA。这可以通过在同一个上共表达Cas9和gRNA,也可以通过在两个各上自表达Cas9和gRNA来实现。使用Cas9和gRNA两个分开表达的优势在于可使用不同的gRNA与不同的Cas9变组合(如Cas9n,dCas9),从而带来更多变的实验方案。 我们的常规Cas9表达质粒可以直接转染哺乳动物,方法如同大多数实验室的传统转染方法一样,操作上非常简便。...
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