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## 概述
我们的体外转录载体是简单有效的RNA转录系统，适用于各种研究。通过mRNA体外转录载体获得的mRNA适用于体外翻译、生物化学研究、注射入细胞或胚胎后的蛋白表达、以及特定序列的其他mRNA应用。
该系统利用目的序列上游的T7启动子，通过T7噬菌体RNA聚合酶（T7
RNAP）和三磷酸核苷酸，在适当的反应条件下高效生成mRNA。我们建议您参考已发表文献中经测试的体外转录步骤说明来进行体外转录。
T7 RNAP对于有效的转录起始具有碱基要求，且这些碱基已经被放置到载体上。T7启动子3'末端的前两个碱基是GG，紧接着是客户的目的序列。
我们的mRNA体外转录载体会发生失控转录，这意味着T7
RNAP的转录能进行到DNA模板的末端，不会在质粒内的任何特定位点终止。因此，在体外转录之前，应通过使用SapI，BsiWI或AscI等限制性内切酶来单酶切线性化环状质粒，以确保转录物的长度和序列，这些单酶切位点紧邻poly（A）序列的下游。值得注意的是，待转录的序列不能含有所用线性化酶切位点，以免产生截短的mRNA。...
## 概述
我们的体外转录载体是简单有效的RNA转录系统，适用于各种研究。小RNA体外转录载体产生的小RNA，适用于生化研究、shRNA敲除或CRISPR/gRNA介导的基因编辑等细胞或胚胎注射，以及需要特定短RNA序列的其他应用。
该系统利用目的序列上游的T7启动子，通过T7噬菌体RNA聚合酶（T7
RNAP）和三磷酸核苷酸，在适当的反应条件下高效生成小RNA。我们建议您参考已发表文献中经测试的体外转录步骤说明来进行体外转录。
T7 RNAP对于有效的转录起始具有碱基要求，且这些碱基已经被放置到载体上。T7启动子3'末端的前两个碱基是GG，紧接着是客户的目的序列。
我们的小RNA体外转录载体会发生失控转录，这意味着T7
RNAP的转录能进行到DNA模板的末端，不会在质粒内的任何特定位点终止。因此，在体外转录之前，应通过使用SapI来单酶切线性化环状质粒。SapI单酶切位点正好位于目的序列的下游。值得注意的是，待转录的序列不能含有所用线性化酶切位点，以免产生截短的mRNA。不纯的酶切产物可能会抑制随后的转录反应，因此建议通过柱子或酚氯仿来纯化酶切产物。...
## 概述
第一次使用显微注射法将DNA递送至线虫体内的实验发生在1991年。在这个实验中，常规质粒DNA被注射到线虫的远端性腺。注射后的DNA进入性腺细胞细胞核中形成染色体以外的质粒微阵列，并可以遗传到下一代。该种技术存在多种局限：首先，常规质粒形成的微阵列在多个世代后其表达水平可能会不稳定。第二，该方式产生的转基因动物是嵌合体，意味着有一些细胞成功转染了而另一些则没有。
关于该载体系统的更多信息，请参照下列文献。
参考文献 | 主题
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EMBO J. 10:3959 (1991) | DNA transformation in C. elegans
Sci Rep. 9:9192 (2019) | Promoter-proximal introns increases gene expression levels in C. elegans.
## 亮点
我们的载体经过专门优化，整合了启动子近端的内含子序列在载体骨架上，可以在线虫中高水平表达目的基因。...
## 概述
常规质粒基因表达载体系统利用LoxP-Stop-
LoxP（LSL）表达盒，在哺乳动物细胞和动物体内实现Cre介导的条件性基因激活表达。LSL表达盒包含三个重复的SV40
polyA，序列两端为LoxP位点。用户选择的启动子位于LSL表达盒的上游，而用户感兴趣的基因位于其下游。在Cre重组酶不存在的情况下，该表达盒完全阻断了目的基因的正常表达；当将Cre引入携带该载体的细胞中时，目的基因上游的LSL表达盒将会被删除，从而目的基因能够在用户选择的启动子下被永久激活表达。
该载体不仅适用于体外细胞培养，更适用于转基因动物模型的构建。当携带这种载体的转基因动物与携带组织特异性表达Cre的转基因动物杂交时，产生的动物后代将在特定的细胞中组织特异性表达Cre，从而启动目的基因在该特定细胞中组织特异性表达。
在细胞培养中使用该载体系统时，可将抗生素或荧光标记添加到载体中，使转染后的细胞可被筛选或可示踪以便于分离出已永久整合载体的细胞。
关于该载体系统和Cre介导重组的更多信息，请参考以下文献。...
## 概述
腺相关病毒（Adeno-associated
virus，AAV）无论在体内和体外试验中均被广泛应用于基因转导实验。AAV可以感染大量种类的哺乳动物细胞，在人体内只产生极低的免疫原性，这些特点使重组AAV成为当今应用于基因治疗的高效病毒载体。在基因治疗的临床前和临床阶段的研究中，可通过Baculovirus-
AAV嵌合病毒载体高效且大规模生产重组AAV以符合剂量和安全性要求。
利用杆状病毒（Baculovirus）生产重组AAV需要将两种杆状病毒共转导昆虫Sf9细胞。第一种杆状病毒表达位于两个AAV
ITR元件之间的目的基因，第二个杆状病毒表达AAV
rep和cap基因。为制备两种杆状病毒，每种杆状病毒的表达框均被克隆至一个杆状病毒转移质粒。该质粒的整个表达框与庆大霉素（Gentamycin）抗性基因位于质粒上的两个Tn7转座子末端序列之间（Tn7L和Tn7R）。该质粒被转化至带有杆粒（Bacmid）和辅助载体的大肠杆菌。杆粒可以被看作一个特别巨大的质粒，包含了修饰过后的杆状病毒基因组序列。该序列上带有lacZ基因以及位于该基因内部的attTn7位点。...
## 概述
CRISPR/Cas9（成簇规则间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9）系统极大地促进了多种物种的体外和体内基因抑制实验。在细胞内，Cas9核酸酶与引导RNA（gRNA）形成复合物，该复合物通过与基因组中的18-22
nt的同源靶序列直接相互作用提供靶向特异性。gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因组中的靶位点。Cas9扫描基因组并切割与gRNA互补的序列，前提是这些序列跟随着一段NGG前间区序列邻近基序（PAM）。双链DNA断裂随后被HDR或者NHEJ途径修复，从而产生不同大小长度的位点突变（碱基插入或缺失）。
使用一个一体化的同时表达Cas9和gRNA的载体，或者分开表达Cas9和gRNA的载体，可以方便地在线虫中进行CRISPR/Cas9编辑。该载体系统属于后者，包含一个线虫密码子优化的Cas9基因。该基因位于一个可加强表达的人工启动子下游，并以一个包含polyA加尾信号序列的3'
UTR结尾。...
## 概述
在哺乳动物细胞和动物中，该常规质粒FLEX（Flip-Excision）条件性基因表达载体系统Cre-
on，通过Cre重组酶条件性激活目的基因的表达。FLEX Cre-on系统利用位于目的基因两侧的Lox-
变体重组位点，在Cre重组酶的调控下目的基因发生反转，目的基因正常表达；而Cre不存在的情况下，目的基因不表达。
FLEX Cre-on系统由两对异型Lox-
变体重组位点组成，其中野生型序列称为LoxP，突变体称为Lox2272，分别位于反向基因ORF（相对启动子方向而言）的两侧。 两种Lox-
变体都可被Cre识别，但只有相同的Lox位点对可以彼此重组，与其他Lox-变体不能进行重组。
LoxP和Lox2272位点以交替方式位于ORF两端，每对位点互为反向。Cre重组酶不存在的情况时，目的基因由于其编码方向与启动子方向相反，所以不发生表达；
在Cre的存在下，LoxP和Lox2272位点对分别重组，导致ORF方向反转为正向，且其中的一对重组位点将具有相同的方向，Cre会介导产生正向重组切割，继而分别留下一个不同的重组位点。...
## 概述
在哺乳动物细胞和动物中，该常规质粒FLEX（Flip-Excision）条件性基因表达载体系统Cre-
off，通过Cre重组酶条件性失活目的基因的表达。FLEX Cre-off系统利用位于目的基因两侧的Lox-
变体重组位点，在Cre重组酶的调控下目的基因发生反转，目的基因不能正常表达；而Cre不存在的情况下，目的基因则正常表达。
FLEX Cre-off系统由两对异型Lox-变体重组位点组成，其中野生型序列称为LoxP，突变体称为Lox2272，分别位于ORF的两侧。 两种Lox-
变体都可被Cre识别，但只有相同的Lox位点对可以彼此重组，与其他Lox-变体不能进行重组。
LoxP和Lox2272位点以交替方式位于ORF两端，每对位点互为反向。Cre重组酶不存在的情况下，客户定制的启动子可以驱动目的基因的正常表达。Cre重组酶存在的情况下，LoxP和Lox2272位点对分别重组，导致ORF方向反转为反向，且其中的一对重组位点将具有相同的方向，Cre会介导产生正向重组切割，继而分别留下一个不同的重组位点。ORF方向的反转，使得目的基因无法正常表达。...
## 概述
PB转座子质粒基因表达载体系统利用LoxP-Stop-
LoxP（LSL）表达盒，在哺乳动物细胞和动物体内实现Cre介导的条件性基因激活表达。LSL表达盒包含三个重复的SV40
polyA，序列两端为LoxP位点。用户选择的启动子位于LSL表达盒的上游，而用户感兴趣的基因位于其下游。在Cre重组酶不存在的情况下，该表达盒完全阻断了目的基因的正常表达；当将Cre引入携带该载体的细胞中时，目的基因上游的LSL表达盒将会被删除，从而目的基因能够在用户选择的启动子下被永久激活表达。
该载体不仅适用于体外细胞培养，更适用于转基因动物模型的构建。当携带这种载体的转基因动物与携带组织特异性表达Cre的转基因动物杂交时，产生的动物后代将在特定的细胞中组织特异性表达Cre，从而启动目的基因在该特定细胞中组织特异性表达。
在细胞培养中使用该载体系统时，可将抗生素或荧光标记添加到载体中，使转染后的细胞可被筛选或可示踪以便于分离出已永久整合载体的细胞。...
## 概述
CRISPR/Cas9（成簇规则间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9）系统极大地促进了多种物种的体外和体内基因抑制实验。在细胞内，Cas9核酸酶与引导RNA（gRNA）形成复合物，该复合物通过与基因组中的18-22
nt的同源靶序列直接相互作用提供靶向特异性。gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因组中的靶位点。Cas9扫描基因组并切割与gRNA互补的序列，前提是这些序列跟随着一段NGG前间区序列邻近基序（PAM）。双链DNA断裂随后被HDR或者NHEJ途径修复，从而产生不同大小长度的位点突变（碱基插入或缺失）。
使用一个一体化的同时表达Cas9和gRNA的载体，或者分开表达Cas9和gRNA的载体，可以方便地在线虫中进行CRISPR/Cas9编辑。该载体系统属于前者，一个载体上同时表达gRNA和一个线虫密码子优化的Cas9（CeCas9）。该载体可以被注射到线虫的远端性腺，然后进入生殖细胞细胞核。筛选突变后代，获得突变可遗传的基因敲除线虫品系。
为了实现在线虫中的高效CRISPR基因编辑，云舟生物开发了gRNA和Cas9共表达载体。...
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