腺病毒体外应用

下表为定制化腺病毒产品的交付内容。可在相应COA（Certificate of analysis document）文件中查看病毒滴度。

*表格所示产品规格适用范围为一般腺病毒载体。

1.腺病毒产品使用干冰冷藏运输。收到病毒后，可直接放置-80℃冷冻保存至少1年，也可放置-20℃条件冷冻保存2-3周。

2.使用前，将病毒液放置冰上进行融解。实验过程中，亦需保持冰上放置。解冻后的腺病毒在4℃下保存1-2周不会造成其生物活性显著降低。

3.若实际用量较少，可将融解的腺病毒少量分装多管，再放置-80℃冷冻保存。

4.根据您的实验用量，可将解冻后的腺病毒少量分装后再次冻存。如果您需要对腺病毒进行稀释，则需要用到PBS，注意现稀释现用。

注意：尽管反复几次冻融腺病毒不会造成其活性显著降低，但请尽量避免这样做。

所有VectorBuilder的腺病毒载体均缺乏E1A，E1B和E3基因。E1A和E1B是产生活病毒所必需的，已通过生物工程的方法导入包装细胞的基因组中。因此，由此类载体产生的腺病毒由于存在复制的缺陷性而具有重要的安全特性，这也就意味着被感染的细胞不能复制出新的病毒颗粒。尽管如此，腺病毒本身具有转导人原代细胞的能力，理论上仍有生物危险的风险。腺病毒作为常见的人类病原体，可引发呼吸道炎症、角膜损伤和角膜结膜损伤等。我们建议按照BSL-2规范（Biosafety Level-2，二级生物安全防护水平）对腺病毒进行操作。所有的操作、储存以及生物肥料的处理均需依照公共机构发布的和所处机构制定的规范条例。 我们强烈建议使用者勿生产活的腺病毒，以免致癌。

哺乳动物细胞转导实验方法

1. 转导前1天（第0天）

• 将一定数量靶细胞接种至一个新的培养皿中（转导时靶细胞的融合度应为30%-50%）。放置37℃、5%CO₂ 的培养箱中培养18-20个小时。例如，当靶细胞为293T时，建议接种3×10⁵个细胞至6孔板的一个孔中。

2. 转导当天（第1天）

• 在冰上融解冻结的病毒液。偶尔情况下，融解后的病毒液会呈现轻微浑浊状态，这是正常现象，不会影响正常使用。为了吸取到准确数量的病毒，请先轻柔吸打，混匀融解后的病毒颗粒，再取适量的病毒液至适量的培养基中，然后轻柔混匀（避免涡旋震荡）。为获得较好的转导效果，培养基用量尽可能少，以覆盖培养皿表面为宜。一般来说，用量约100 µl/cm²。例如，当在6孔板中进行转导时，建议1个孔使用1 mL培养基（6孔板一个孔的表面面积约10 cm²）。

  注意：对于不难感染的细胞，转导细胞的初始MOI可在1-10之间。对于较难感染的细胞，可能需要更高的MOI。

• 吸出原有培养基，然后向细胞中加入含有病毒的培养基。
• 轻柔地摇动培养板以使病毒液都能覆盖每一处细胞。放置于37℃、5%CO₂ 的培养箱中培养过夜。

  注意：如果您担心细胞暴露在病毒液中太久可能会影响细胞状态，可以将转到时间缩短在6-8小时。

3. 第2天

• 换液，吸出含有病毒的培养基，加入新鲜的完全培养基，放置于37℃、5%CO₂ 的培养箱中培养过夜。

4. 第3天及之后

• 转导后，需要在理想的时间点分析目的基因的表达情况。一般而言，转导后24-48时，目的基因明显表达。

  注意：在分裂活跃的细胞中（如倍增时间约为24小时），转导后24小时内即可检测转基因的表达；在转导后第48-96小时（第2-4天）表达量达到最大；转导5天后，表达水平通常会开始下降。对于分裂周期较长或者无分裂行为的细胞系而言，高水平的转基因表达则通常会持续更长时间。如果您是第一次用构建好的腺病毒转导您的哺乳动物细胞，我们建议进行时间摸索实验，以确定目的基因的最佳表达时间。

成功转导实例

图1所示为成功转导的一个实例。

图1. 按照本文实验方案，使用表达绿色荧光蛋白的腺病毒以MOI=50转导293T细胞。100×参数下拍照。 左图：明视野；右图：绿色荧光。