AAV 腺相关病毒体外应用

交付内容

下表为定制化腺相关病毒产品的交付内容。可在相应COA（Certificate of analysis document）文件查看病毒滴度。

产品类型交付内容产品规格应用范围
小规格包装定制病毒浓缩病毒（ ＞1011 GC/ml，10×25 µl ，PBS保存液 ）体外培养细胞
对照病毒浓缩病毒（ ＞1011 GC/ml，1×100 µl ，PBS保存液 ）体外培养细胞
中规格包装定制病毒浓缩病毒（ ＞1011 GC/ml，10×100µl ，PBS保存液 ）体外培养细胞
对照病毒浓缩病毒（ ＞1011 GC/ml，2×100 µl ，PBS保存液 ）体外培养细胞
大规格包装定制病毒浓缩病毒（ ＞1012 GC/ml，10×100 µl ，PBS保存液 ）体外培养细胞
对照病毒浓缩病毒（ ＞1011 GC/ml，2×100 µl ，PBS保存液 ）体外培养细胞
小规格包装和超纯化定制病毒超纯化病毒（ ＞1013 GC/ml，4×25 µl ，PBS保存液 ）动物体内
对照病毒超纯化病毒（ ＞1013 GC/ml，4×25 µl ，PBS保存液） （选购 ）动物体内
中规格包装和超纯化定制病毒超纯化病毒（ ＞1013GC/ml，10×50 µl ，PBS保存液 ）动物体内
对照病毒超纯化病毒（ ＞1013 GC/ml，10×50 µl ，PBS保存液） （选购 ）动物体内
大规格包装和超纯化定制病毒超纯化病毒（ ＞1013GC/ml，10×100 µl ，PBS保存液 ）动物体内
对照病毒超纯化病毒（ ＞1013 GC/ml，10×100 µl ，PBS保存液） （选购 ）动物体内
接收病毒后的处理

1. 腺相关病毒产品使用干冰冷藏运输。收到病毒后，可直接放置-80°C冷 冻保存至少1年，也可放置-20°C冷冻保存2-3周。

2. 使用前，将病毒液放置冰上进行融解。实验过程中，亦需保持冰上放 置。融解后的腺相关病毒可放置4°C保存1-2周（在4°C条件下，腺相 关病毒比慢病毒相对稳定，一般不会出现显著的活性降低问题）。

3. 若实际用量较少，可将融解的腺相关病毒少量分装多管，再放置-80°C冷冻保存。如果您需要对腺相关病毒进行稀释，请使用PBS现稀 释现用。

注意： 应避免反复冻融。腺相关病毒较之其他多种病毒更为稳定，尽管反复冻融不会造成其活性显著降低，但请尽量避免反复冻融。

安全须知

所有VectorBuilder的腺相关病毒的基因组是由重组转基因序列及其两侧的腺相关病毒反向末端重复序列（ITRs） 组成。 ITRs序列只占到了野生型腺相关病毒基因组序列的6% ，也是载体上唯一的腺相关病毒特异序列。几乎所有病毒结构基因都被 删除掉，这使得该病毒不能自我复制，唯有依赖腺病毒反式辅助进行复制。我们使用辅助质粒表达病毒复制相关基因，而不 是腺病毒。通过将3个质粒（1个携带顺式ITR元件的质粒，1个编码腺相关病毒复制酶和衣壳蛋白的反式质粒以及1个表达部分腺病毒基因的辅助质粒）同时瞬转293T细胞制备出腺相关病毒颗粒。这种方法可制备出不同的血清型腺相关病毒。 重组腺相关病毒是从对人体没有致病性的野生型病毒改造而成。野生型腺相关病毒的复制依赖于腺病毒或者疱疹病毒，一旦 这些辅助病毒不存在，野生型病毒会稳定整合到宿主细胞基因组中。重组腺相关病毒通常主要以游离的形式存在于靶细胞 中，整合效率极低。我们建议按照BSL-2规范（Biosafety Level-2 ，二级生物安全防护水平）对腺相关病毒进行操作。所有 的操作、储存以及生物废料的处理均需依照公共机构发布的和所处机构制定的规范条例。

靶细胞转导

腺相关病毒的转导效率与细胞类型有关。有些细胞类型显示较低的转导效率，而有些细胞类型则显示较高的效率。在设计腺 相关病毒的转导实验时，可使用表达绿色荧光蛋白的不同血清型的腺相关病毒来确定待转导组织或者细胞的最适血清型。对 于不难感染的细胞，转导细胞的初始MOI可在 1×104 - 1×106 genome copy（GC）之间。对于较难感染的细胞则需要更高 的MOI。一般来说，选择那些转导效率高但细胞死亡率最低的MOI。而对某些细胞种类而言，无论怎么调整MOI ，也可能无法获得较高的转导效率。

哺乳动物细胞转导实验方法

1. 转导前1天（第0天）

  • 将一定数量靶细胞接种至一个新的培养皿中（转导时靶细胞的融合度应为30%-50%）。放置37°C、 5% CO2 的培养箱中培养18-20个小时。例如，当靶细胞为293T时，建议接种3×105个细胞至6孔板的一个孔中。

2. 转导当天（第1天）

  • 了吸取到准确数量的病毒，请先轻柔吸打，混匀融解后的病毒颗粒，再取适量的病毒液至适量的培养基中，然后轻柔混 匀（避免涡旋震荡）。为获得较好的转导效果，培养基用量尽可能少，以覆盖培养皿表面为宜。一般来说，用量约100 ul/cm2 。例如，当在6孔板中进行转导时，建议1个孔使用1 ml培养基（ 6孔板一个孔的表面面积约10 cm2）。吸出原有培养基，然后向细胞中加入含有病毒的培养基。
  • 轻柔地摇动培养板以使病毒液都能覆盖每一处细胞。放置于37°C、5% CO2 的培养箱中培养过夜。
  • 注意：如果您担心细胞暴露在病毒液中太久可能会影响细胞状态，可以将转导时间缩短在6-8小时。

3. 第2天

  • 换液。吸出含有病毒的培养基，加入新鲜的完全培养基，放置于37°C、5% CO2 的培养箱中培养过夜。

4. 第3天及之后

  • 转导后，需要在理想的时间点分析目的基因的表达情况。一般而言，转导后24-48小时，目的基因明显表达。

    注意：对于分裂活跃的细胞（如倍增时间约为24小时），转导后24小时内即可检测到转基因的表达，在转导后第48-96小 时（第2-4天）表达量达到最大，转导5天后，表达水平通常会开始下降。对于分裂周期较长或者无分裂行为的细胞，高水 平的转基因表达则通常会持续更长时间。如果您是第一次使用重组腺相关病毒转导哺乳动物细胞，建议您先进行时间摸索 实验，以确定目的基因的最佳表达时间。

成功转导实例

图1所示为成功转导的一个实例。

图1. 按照本文实验方案，使用表达绿色荧光蛋白的AAV2型腺相关病毒以MOI=10000转导293T细胞。100×参数下拍照。左图：明视野；右图：绿色荧光。