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哺乳动物基因Tet-On诱导表达质粒载体 (Low leak)

概述

Tet-On诱导型基因表达系统是控制哺乳动物细胞中目的基因定时表达的强大工具。Tet-On诱导型基因表达载体作用:当不存在四环素及其类似物(如doxycycline)的情况下,目的基因几乎或完全沉默;当往体系中添加四环素或其他类似物(如doxycycline)时,目的基因得到快速高水平表达。四环素不存在的情况下时,衍生于TeR(Tet抑制蛋白)和KRAB-AB(Kid-1蛋白转录抑制结构域)的融合蛋白tTS结合TRE启动子,导致基因转录抑制。另一方面,四环素存在时,衍生于突变型Ter抑制蛋白和VP16蛋白(转录激活结构域)的融合蛋白rtTA结合TRE启动子,激活基因转录。

除了以tTS和rtTA融合蛋白作为基因转录激活的开关的标准Tet-On载体系统,我们还提供专门为组织特异表达设计低泄露型(Low leak)Tet-On载体系统。这种实验通常要求在靶组织处四环素存在,而非靶组织处无四环素作用。该载体上存在三个表达盒:1. TRE启动子驱动的GOI表达;2. 通用启动子驱动的tTS基因表达;3. 用户自定义启动子驱动的rtTA基因表达。当四环素不存在时,通用启动子驱动tTS在所有组织中表达。tTS结合TRE启动子,导致GOI在所有组织中的转录抑制。四环素存在时,rtTA被在靶组织被转录并结合TRE启动子,从而激活GOI在靶组织中表达。

常规Tet-On质粒载体可以用质粒转染的方式导入多种多样的哺乳动物细胞。在生物医学领域,利用常规转染将质粒载体转到哺乳动物细胞中是使用最广泛的方法。虽然近年来开发了不少更为先进的基因导入载体系统(如慢病毒载体、腺病毒载体、AAV载体和piggyBac等),但常规质粒基因表达载体仍被大多数实验室使用,这主要得益于其在技术上的简便性以及在各种类型细胞中的高效转染率。常规质粒载体转染的关键特点是短暂性,并且在宿主基因组中的整合效率非常低(通常小于1%)。

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献主题
Science. 286:1766 (1995)Development of rtTA.
J Gene Med. 1:4 (1999)Development of tTS
Semin Cell Dev Biol. 13:121 (2002)Review on Tet-based systems
亮点

我们的Tet-On诱导型基因表达载体旨在—当缺乏四环素时,实现目的基因的几乎或完全沉默;当往体系中添加四环素时,目的基因得到快速高水平表达。Low leak型Tet-On载体系统是一种改进版本,可以让目的基因在四环素存在的情况下于靶组织特异表达,而在非靶组织减少其表达至极低水平。我们的载体系统已经过优化,其在大肠杆菌中具有高拷贝复制能力,且对细胞具有高效转染率。

优势

类似开关的严格基因表达调控:只依赖rtTA的Tet-on系统在没有诱导剂的情况下,会有明显的泄露表达。我们的Tet-On基因表达载体可严格调控基因的表达,在没有诱导剂的情况下可将背景泄露表达最小化,并保持该系统对四环素诱导的高灵敏度。

在非靶组织最小化泄露表达:我们的Low leak版本Tet-On载体系统整合有CBh启动子驱动tTS表达。无四环素作用时,非靶组织区域的tTS结合TRE启动子,抑制了目的基因的转录表达。

载体容量非常大:我们的载体总容量可达30 kb,其中质粒骨架和Tet-On元件只占5.2kb,有足够大的容量可以放置客户所感兴趣的序列。

高水平表达:TRE启动子可驱动目标基因在诱导状态下高水平表达。 另外,常规质粒转染细胞后,可以产生非常高的拷贝数(每个细胞多达几千拷贝),使外源基因能高水平表达。

不足之处

载体DNA非整合型:常规质粒在细胞里主要以游离DNA状态存在,所以常规质粒转染也称为瞬时转染。然而,质粒DNA也可以以非常低的概率永久整合到宿主基因组中(质粒转染每102~106个细胞可能会有一个细胞的基因组被整合,整合效率取决于细胞类型)。如果将携带了药物抗性基因或者荧光标记基因的载体转到细胞中,在经过扩大和传代培养后,可以使用药物筛选或细胞分选来获得稳定整合了该载体的细胞。

可转染的细胞类型受限:不同类型细胞的质粒转染效率差异很大。非分裂细胞比分裂细胞更难转染,原代细胞比永生化细胞系更难转染。一些重要的细胞类型更是难以转染,如神经元和胰岛β细胞。另外,质粒转染局限于体外细胞实验,很少运用到活体实验。

基因拷贝数在不同细胞中呈现差异性:尽管成功的转染可以在单个细胞里产生非常高的拷贝数,但不同细胞间却有高度的差异性。在一些细胞中,质粒拷贝数非常高,而在另外一些细胞却是低拷贝甚至没有。而病毒转导更倾向于相对均匀地把基因转到细胞中。

载体关键元件

TRE promoter: Tetracycline-responsive element promoter (2nd generation). This element can be regulated by a class of transcription factors (e.g. tTA, rtTA and tTS) whose activities are dependent on tetracycline or its analogs (e.g. doxycycline).

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

rBG pA: Rabbit beta-globin polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

Promoter: The tissue-specific promoter chosen to drive expression of the rtTA protein.

rtTA: Reverse tetracycline responsive transcriptional activator M2 (2nd generation). This protein binds to TRE promoter to activate gene transcription only in the presence of tetracycline or its analogs (e.g. doxycycline). It has higher sensitivity to the inducing drug and lower leaky activity in the absence of the drug compared to its predecessor.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream rtTA protein.

CBh promoter: CMV early enhancer fused to modified chicken β-actin promoter. This drives the expression of the downstream tTS protein.

tTS: Tetracycline-controlled transcriptional silencer. This protein binds to TRE promoter to actively suppress gene transcription only in the absence of tetracycline and its analogs (e.g. doxycycline).

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream tTS protein.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.