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载体指南

哺乳动物Cas9表达腺病毒载体

概述

CRISPR/Cas9(规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白9)核酸酶表达载体属于几种新兴的基因组编辑工具之一(另外两种是ZFN和TALEN),可在基因组的靶位点快速有效地产生突变。这些质粒载体编码的特异性RNA,能够引导DNA核酸酶(或缺刻酶)编辑基因组中特定位点的DNA序列。

Cas9是RNA引导DNA核酸酶,是天然原核免疫系统的一部分,赋予细菌产生对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抵抗能力。在细胞内,Cas9核酸酶与引导RNA(gRNA)形成复合物,该复合物通过与基因组中的18-22nt的同源靶序列直接相互作用,gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上,然后切割基因组中的靶位点。 

使用CRISPR打靶目的基因需要目标细胞同时表达Cas9和特异gRNA。这可以通过在同一个载体上共表达Cas9和gRNA,也可以通过在两个载体各上自表达Cas9和gRNA来实现。使用Cas9和gRNA两个载体分开表达的优势在于可使用不同的gRNA与不同的Cas9变体组合(如野生型Cas9,Cas9n,dCas9),从而根据实验目的带来更多变的实验方案。

Cas9表达腺病毒载体系统可以有效地在多数哺乳动物细胞中表达Cas9蛋白,但是其载体为游离形式存在于细胞中,不整合宿主基因组。腺病毒常用于体内基因转导,以及基因治疗和疫苗研究领域。

Cas9表达腺病毒载体首先以质粒的方式构建并使用E. coli扩增,然后转染进入包装细胞。在包装过程中,位于两个反向重复序列(ITR)之间的DNA片段与由包装细胞表达的病毒蛋白进一步包装成病毒颗粒。当病毒转导宿主细胞时,载体并以游离DNA的形式存在于细胞核中。两个ITR区域之间的Cas9基因和其他病毒基因组分由此进入了细胞。

通过改造优化,我们的腺病毒载体缺失了E1A、E1B和E3区,前两者与病毒包装相关(这两个基因已被整合到包装细胞的基因组中)。因此,运用我们的病毒载体包装出来的病毒是复制缺陷型的(只能转导靶细胞而不能自我复制),大大提高了生物安全性。

我们提供多种版本的来源于Streptococcus pyogenes的SpCas9。这其中包括hCas9,人源化的野生型SpCas9,能有效地在靶序列制造DNA双链断裂(DSB);hCas9-DA10,核酸酶突变型的人源hCas9,只对靶序列的DNA单链造成切口;dCas9,bao'hanD10A和H840A突变,属于无核酸酶活性的SpCas9;SpCas9-HF1,亲和性强化的SpCas9;以及eSpCas9,特异性强化的SpCas9。dCas9融合转录激活结构域如dCas9/VP64和dCas9/VPR,或者融合转录抑制结构域后,如dCas9/KRAB,可分别应用于CRISPRa和CRISPRi系统。此外,我们提供的来源于Staphylococcus aureus的SaCas9,其序列要比SpCas9和来源于Acidaminococcus的AsCpf1更短(AsCpf1属于新一代CRISPR基因编辑系统。AsCpf1造成DSB时,两条DNA链上的切口位置相互错开,形成粘性末端)。

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Science. 339:819 (2013) Description of genome editing using the CRISPR/Cas9 system
Nat. Biotech. 31:827 (2013) Specificity of RNA-guided Cas9 nucleases
Nat. Commun. 9:1911 (2018) Review on various Cas9 variants
Sci Rep. 4:5105 (2014) CRISPR/Cas9 targeting by adenoviral vectors
亮点

我们的Cas9表达腺病毒载体由血清型5(Ad5)腺病毒衍生而来。经优化,该载体系统在大肠杆菌体内具有很高的拷贝数,包装的活病毒具有很高的滴度,对大多数宿主细胞具有高效的转导能力,能有效地把载体整合到靶细胞基因组并实现外源基因的高水平表达。Cas9表达腺病毒载体可实现用户自定义启动子驱动下的高水平Cas9表达。我们可提供多种类型的Cas9蛋白以满足不同的实验需求。

优势

灵活性:单Cas9表达载体可以与多个不同的gRNA共转染靶细胞打靶多个位点。此外,单Cas9表达载体可以通过慢病毒转导构建稳转细胞株。经FACS或抗生素筛选后,Cas9高水平表达的稳转细胞株可被用来接受gRNA转染从而获得高效的打靶率。

对宿主基因组造成破坏的低风险性:在转导进入靶细胞后,腺病毒载体在细胞核保持着游离DNA的状态,可以降低宿主基因组被破坏而致癌的风险,使其成为人类体内实验的理想载体。

超高病毒滴度:腺病毒可通过再次转导包装细胞而得到大量扩增,从而获得超高滴度病毒,慢病毒载体、逆转录病毒载体和AAV载体都不具有这个特性。我们提供的腺病毒滴度可以达到>1010 IFU/ml。

宿主范围广泛:来源于人、小鼠和大鼠等常用哺乳动物细胞都能被腺病毒载体转导,但某些细胞类型则比较难转导(见下文不足之处)。

体内外实验均有效:我们的载体不仅能用于体内活体动物实验,还具有体外细胞转导能力。

安全性:为了确保腺病毒载体的生物安全性,我们的腺病毒载体缺失了病毒包装所必须的基因(这些基因被整合到包装细胞的基因组)。 所以,利用我们的腺病毒载体包装出来的病毒是复制缺陷型的,并且只有在包装细胞中才具有复制能力。

不足之处

载体DNA非整合型:腺病毒基因组不会整合到靶细胞的基因组中,而是以游离DNA的形式存在,并且随着时间推移逐渐丢失,特别是在分裂细胞中。

难以转导特定类型的细胞:虽然我们的腺病毒载体可以转导很多类型的细胞包括非分裂细胞,但对某些特定类型的细胞如内皮细胞、平滑肌细胞、呼吸上皮分化细胞、外周血细胞、神经元和造血干细胞等,却无法进行有效的转导。

较强的免疫原性:活腺病毒会在动物体内引起强烈的免疫反应,从而限制了其在体内的某些应用。

技术复杂:使用腺病毒载体时,需要在包装细胞中产生活病毒,然后测定病毒滴度。因此腺病毒转染相对于常规质粒转染,技术难度更高,周期更长。通过选择我们xia病毒包装服务可以有效缩短包装周期。

PAM序列依赖: CRISPR/Cas9靶向特定位点时对gRNA识别序列3'端的PAM序列有严格要求。不同类型的Cas9蛋白需要使用不同的PAM序列。

载体关键元件

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wild type virus, 5' ITR and 3' ITR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome pointing in opposite directions, where they serve as the origin of viral genome replication.

Ψ: Adenovirus packaging signal required for the packaging of viral DNA into virus. 

Promoter: The promoter that drives the expression of the downstream Cas9 gene is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of the Cas9 nuclease variant chosen by the user.

TK pA: Herpes simplex virus thymidine kinase polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

ΔAd5: Portion of Ad5 genome between the two ITRs minus the E1A, E1B and E3 regions.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat.

pBR322 ori: pBR322 origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in medium copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

PacI: PacI restriction site (PacI is a rare cutter that cuts at TTAATTAA). The two PacI restriction sites on the vector can be used to linearize the vector and remove the vector backbone from the viral sequence, which is necessary for efficient packaging.