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载体指南

哺乳动物CRISPR(SagRNA与SaCas9共表达)ssAAV载体

概述

CRISPR/Cas9(规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白9)核酸酶表达载体属于几种新兴的基因组编辑工具之一(另外两种是ZFN和TALEN),可在基因组的靶位点快速有效地产生突变。这些质粒载体编码的特异性RNA,能够引导DNA核酸酶(或缺刻酶)编辑基因组中特定位点的DNA序列。

Cas9是RNA引导DNA核酸酶,是天然原核免疫系统的一部分,赋予细菌产生对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抵抗能力。在细胞内,Cas9核酸酶与引导RNA(gRNA)形成复合物,该复合物通过与基因组中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用,gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上,然后切割基因组中的靶位点。为了方便使用,我们设计的CRISPR/Cas9载体能够在一个载体上同时有效表达Cas9核酸酶(或缺刻酶)和引导RNA(gRNA)。

使用CRISPR打靶目的基因需要目标细胞同时表达Cas9和特异gRNA。这可以通过在同一个载体上共表达Cas9和gRNA,也可以通过在两个载体各上自表达Cas9和gRNA来实现。使用Cas9和gRNA两个载体分开表达的优势在于可使用不同的gRNA与不同的Cas9变体组合(如Cas9n,dCas9),从而带来更多变的实验方案。

我们的AAV SagRNA表达载体是专门搭配SaCas9使用的。SaCas9来源于Staphylococcus aureus,其序列比来源于Streptococcus pyogenes的SpCas9要短1 kb以上。因此较小长度的SaCas9序列更适合小装载量的AAV病毒的包装生产。SaCas9与SpCas9有两个方面的差异:第一,SaCas9要求搭配的gRNA的骨架序列与SpCas9要求的不同。与SaCas9适配的gRNA叫SagRNA;第二,SaCas9识别的PAM序列是NNGRR(优先NNGRRT),而SpCas9识别的PAM序列为NGG(较多情况)和NAG(少数情况)。

我们的AAV SagRNA表达载体既可以表达单SagRNA也可以表达双SagRNA。单SagRNA被常用于传统的基因编辑如基因敲除,而双SagRNA适用于需要用2个gRNA同时打靶基因组两个区域的情况,如造成两个DSB之间的片段删除,同时打靶两个不同的基因等当一个SagRNA载体上含有单个人U6启动子时可以驱动两个ITR区域之间的单SagRNA表达。双SagRNA载体则含有两个U6启动子用以驱动两个特异于打靶序列的SagRNA表达。

AAV SagRNA表达载体首先在构建可在E. coli中复制的质粒DNA,然后与辅助质粒一并转染至包装细胞。位于载体上的两个ITR区域之间的序列将被包装至有活性的病毒颗粒当中。病毒转导时,两个ITR区域之间的SagRNA表达盒连同病毒基因组的其他组分都会进入靶细胞。表达盒中的人源U6启动子将驱动SagRNA序列转录。SagRNA随后引导SaCas9打靶目的序列。

野生型AAV基因组(ssAAV)是一条线性单链DNA分子(ssDNA),并含有两个ITR区域在基因组的两端形成发夹结构。ssAAV在细胞内进行表达时,其基因组首先需要被转化成双链DNA(dsDNA),这个过程有两个途径:1. 使用宿主细胞的DNA聚合酶和ssAAV基因组上的3’ ITR序列作为引物结合点合成第二链DNA;2. ssAAV基因组的正义链和负义链之间形成分子内的dsDNA结构。两种途径中前者是形成dsDNA的主要方式。

AAV线性双链DNA基因组在细胞核内会形成游离形式的多联体。在非分裂细胞中,这些多连体会长久存在直到宿主细胞死亡。而在分裂细胞中,游离的DNA多联体会因为细胞分裂而被稀释,这是因为游离DNA不能随着宿主基因组复制而复制。AAV基因组随机整合宿主基因组的概率是很小的。AAV的这种特性对于应用于基因治疗是可贵的,因为载体上的外源DNA整合宿主基因组的情况是有潜在的致癌性质的。

AAV的一个主要优点是,在大多数情况下,可以在生物安全1级(BSL1)设施中操作。AAV是复制缺陷型的、不会引起炎症反应和引发人类疾病。有赖于AAV对宿主的低免疫原性,我们的ssAAV gRNA表达载体是体内CRISPR应用的完美工具。

人们已从自然界中鉴定出许多AAV病毒株,根据病毒表面衣壳蛋白的不同抗原将它们分成不同的血清型。不同血清型的病毒具有不同的组织亲和性(即感染组织特异性)。当我们的AAV载体使用不同的衣壳蛋白包装病毒时,则会赋予病毒不同的血清型。下表列出了不同的AAV血清型及对应的组织嗜性。

血清型 组织嗜性
AAV1 Smooth muscle, CNS, lung, retina, pancreas, heart, liver
AAV2 Smooth muscle, CNS, liver, kidney, retina
AAV3 Smooth muscle, liver, lung
AAV4 CNS, retina, lung, kidney
AAV5 Smooth muscle, CNS, lung, retina
AAV6 Smooth muscle, heart, lung, adipose, liver
AAV6.2 Lung, liver
AAV7 Smooth muscle, retina, CNS, liver
AAV8 Smooth muscle, CNS, retina, liver, pancreas, heart, kidney, adipose
AAV9 Smooth muscle, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, testes, kidney
AAVrh10 Smooth muscle, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, kidney
AAV-DJ Liver, heart, kidney, spleen
AAV-DJ/8 Liver, brain
AAV-PHP.eB CNS
AAV-PHP.S PNS
AAV2-retro Spinal nerves 
AAV2-QuadYF Endothelial cell

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Science. 339:819 (2013) Description of genome editing using the CRISPR/Cas9 system
Genome Biol. 16:257 (2015) Characterization of Staphylococcus aureus Cas9
Nature. 520:186 (2015) In vivo genome editing with SaCas9-based AAV vectors
Plos One. 12: e0187236 (2017) CRISPR/Cas9 vectors for dual gRNA expression
亮点

我们的AAV载体是经过优化的,可在大肠杆菌中进行高拷贝复制,是一个包装病毒滴度高,细胞转导效率高,转基因高水平表达的载体系统。该载体可用所有载体家提供的衣壳蛋白血清型的辅助质粒进行包装,包装出来的病毒具有非常高的转导效率,且具有极高的生物安全性。

优势

适用于基于SaCas9的CRISPR实验应用:我们的SagRNA表达载体是专门为搭配来源于Staphylococcus aureus的SaCas9使用的。SaCas9序列比来源于Streptococcus pyogenes的SpCas9要短1kb以上,因此更适合小装载量的AAV病毒包装。

安全性:AAV是可供选择的最安全的病毒载体,它是复制缺陷的,不会引起任何人类疾病。

对宿主基因组造成破坏的低风险性:在转导进入靶细胞后,AAV病毒载体在细胞核保持着游离DNA的状态,可以降低宿主基因组被破坏而致癌的风险,使其成为人类体内实验的理想载体。

高病毒滴度:利用我们的AAV病毒载体可以包装成高滴度的病毒。我们提供的病毒包装服务病毒滴度可达到>1013 GC/ml。

宿主范围广:针对不同来源的常用哺乳动物(如人、小鼠和大鼠)细胞和组织,将我们的AAV载体包装成对其具有亲和性的血清型,可轻易实现高效转导。但是,某些类型的细胞仍然难以转导(见下文不足之处),这与所用的血清型有关。

体内外实验均有效:我们的载体不仅能用于体内活体动物实验,还具有体外细胞转导能力。

不足之处

难以转导特定类型的细胞:当利用合适的血清型进行包装时,我们的AAV载体系统可以转导很多不同类型的细胞,包括非分裂细胞。不同AAV血清型对不同类型的细胞具有不同的亲嗜性,针对某种特定类型的细胞需要特定血清型。

技术复杂:使用AAV病毒载体时,需要在包装细胞中产生活病毒,然后测定病毒滴度。这些过程相对于常规质粒转染,技术难度更高,周期更长。在订购载体的同时,可以通过订购我们的病毒包装服务轻松解决这些问题。

PAM序列依赖:我们的AAV SagRNA表达载体是搭配来源于Staphylococcus aureus的SaCas9使用的。SaCas9介导的CRISPR打靶依赖于位于gRNA识别序列3’末端的PAM序列NNGRR(优先NNGRRT)。

载体关键元件

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wild type virus, 5' ITR and 3' ITR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome pointing in opposite directions, where they serve as the origin of viral genome replication.

U6 Promoter: Drives expression of the downstream SagRNA sequence. This is the promoter of the human U6 snRNA gene, an RNA polymerase III promoter which efficiently expresses short RNAs.

Guide sequence: Specifies the target sequence for the SaCas9 nuclease.

gRNA scaffold: Structural portion of the gRNA to allow complexing with SaCas9.

Terminator: Terminates transcription of the gRNA.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early enhancer/promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream SaCas9 gene.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

SaCas9: SaCas9 nuclease derived from Staphylococcus aureus.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat. See description for 5’ ITR.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.