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VECTOR FAQ

为什么我的荧光蛋白这么弱?

低到中等程度的抗性基因表达就能让细胞获得对药物的抗性。相反,荧光蛋白(FP)则需要高水平的表达才能获得明亮的荧光信号,较低或者中等程度的荧光表达会产生较弱的荧光信号,甚至会低于设备检测的最低临界值。此外,某些荧光蛋白(如EBFP)比常用荧光蛋白(如EGFP)更暗淡,特别难以检测。一些研究人员不得不使用抗荧光蛋白抗体,以可视化体外细胞培养或体内的荧光蛋白。以下是导致荧光不良的最常见原因:

弱启动子驱动荧光蛋白的表达

有一些启动子本身就比较弱(如UBC),只能驱动荧光蛋白的弱表达。有的启动子(如CMV)可以在体外细胞培养中很好地起作用,但有时在体内会沉默。当表达荧光蛋白时,您应该尽可能尝试使用一个强的广泛性启动子(如EF1A或CAG)。如果您必须使用组织特异性启动子,请尽可能选择一个表达能力强的;如果您必须使用弱或很弱的启动子,请为荧光蛋白信号不足的可能性做好准备。当这种情况发生时,这并不意味着您的荧光蛋白没有表达,它可能只是表达量不高。您可以使用更灵敏的检测方法,如RT-PCR或免疫荧光进行检测。

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在慢病毒和MMLV载体中表达荧光蛋白

对于逆转录病毒载体系统(慢病毒或者MMLV),聚腺苷酸化信号(poly A)不能存在于LTR之间,因为这会抑制病毒的包装。多聚腺苷酸化信号存在于3'LTR中,来自上游启动子的转录会经过上游ORF的末尾继续往下游的启动子和ORF转录,这会导致下游ORF的表达部分受到抑制。当下游ORF为荧光蛋白时,其表达会大大减少。您可以采取如下措施提高荧光蛋白的表达:

  • 使用不同的载体系统,比如使用常规载体,腺病毒载体或腺相关病毒载体

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  • 使用荧光更强的荧光蛋白变体(如TurboGFP代替EGFP)

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  • 如果考虑在多顺反子的上游表达盒表达荧光蛋白,您可以使用2A linker连接目的基因和荧光蛋白基因。然而,这可能会影响多顺反子中其他ORF的生物学功能,也可能导致荧光蛋白表达较弱(见下文),且会增加载体构建的成本和时间。

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在多顺反子中表达荧光蛋白

当在多顺反子中表达荧光蛋白基因时,通常会存在以下所述问题,且有时荧光蛋白基因的表达与上游下游ORF有关。

  • 荧光蛋白基因在IRES的下游

    在包含一个或多个IRES元件的多顺反子中,与上游ORF相比,下游ORF表达水平比较低(通常为上游的10%-20%)。如果一个荧光蛋白在IRES的下游表达,则荧光会较弱。如果您必须在多顺反子的下游表达荧光蛋白,您可以考虑使用2A肽(如P2A或T2A),而不是IRES。通过使用2A肽,多顺反子下游ORF通常与上游ORF的表达量相当(或稍微低一点)。然而,2A肽也有缺陷,如可能会影响靶基因(GOI)的功能。当存在多个2A肽时,下游ORF倾向于以较低水平表达。另外,2A肽的自我切割并不是100%有效的,其效率会受上下游ORF序列的影响。因此,不能进行有效自我切割的融合蛋白将会是一种翻译产物,在某些实验运用中,这是一个值得注意的问题。需要特别注意的是2A肽的切割会在上游蛋白的C末端留下额外的短肽,并在下游蛋白的N末端留下额外的脯氨酸。在大多数实验应用中,这种情况不会产生不良影响,但是在某些情况下可能会影响蛋白功能。

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  • 荧光蛋白是融合蛋白的一部分

    融合蛋白几乎总是表现出比未融合蛋白较弱的荧光(比如EGFP/Neo融合蛋白的荧光比单独的EGFP荧光更弱)。此外,未经测试的融合蛋白可能存在胞内不稳定,错误折叠或无功能等问题。如果您怀疑这些是荧光弱的原因,可以尝试以下操作:

    • 使用更强的启动子(例如EF1A)来驱动融合基因的表达

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    • 以非融合形式表达荧光蛋白

    • 使用更亮的荧光蛋白变体(如TurboGFP代替EGFP)

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    • 增加一个linker,或者使用不同的linker来连接荧光蛋白和目的基因

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    • 调换荧光蛋白和目的基因的位置

荧光蛋白本身亮度低

一些荧光蛋白本身比同一颜色家族的其它种类荧光更暗。例如在蓝色家族中,EBFP的亮度仅为TagBFP亮度的三分之一。我们建议您根据我们的荧光报告基因指南选择一个更亮的荧光蛋白变体。

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