我应该在多顺反子表达盒中使用IRES还是2A肽(以及哪个2A肽)?

当您希望使用单个启动子驱动多个ORF的表达时,您可以选择将多个ORF置于启动子后面,通过连接子(linkers)如内部核糖体进入位点(IRES)或2A肽将每个ORF分隔开,单个mRNA转录物将会产生多个蛋白。

作用机制

最常用的IRES元件来源于脑心肌炎病毒(EMCV),作为额外的核糖体募集位点起作用,允许翻译起始发生在除了翻译起始位点之外的mRNA内部区域。

2A肽是来源于病毒的短肽(〜18-25个氨基酸),它们通常被称为“自我剪切”肽,能使一条转录产物产生多种蛋白。2A肽并不是完全的“自我剪切”,而是通过使核糖体跳过2A元件C-末端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用,最终导致2A序列末端和下游产物分离。其中,上游蛋白的C端将会添加一些额外的2A残基,而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。目前有四种常用的2A肽,分别是P2A,T2A,E2A和F2A,来源于四种不同的病毒。

两种连接子(linkers)的优缺点

IRES优于2A肽的关键优势在于它不影响上下游ORF的蛋白序列。

IRES的主要缺点是与上游ORF相比,下游ORF的表达水平比较低(通常为上游的10%-20%)。这就是为什么当人们在IRES后表达荧光蛋白时,常常难以获得可检测的荧光信号,特别是在体内应用。此外,IRES元件的大小(>500 bp)也可能会增加载体构建和病毒包装的难度。

2A肽优于IRES的关键优势在于下游ORF的表达水平与上游ORF相当(或者略小于)。

2A肽的缺点可能是会在上下游ORF留下附加残基,从而可能产生不良影响。2A肽的自我切割并不是100%有效的,其效率会受上下游ORF序列的影响。因此,不能进行有效自我切割的融合蛋白将会是一种翻译产物,在某些实验运用中,这是一个值得注意的问题。

如果您的实验不需要第二个ORF的高水平表达(如药物筛选标记),那么IRES应该是可以满足实验要求的。然而,如果多顺反子中存在两个以上的ORF,或者等量共表达多个ORF很重要,我们建议您使用2A肽。

不同2A肽的比较

在四种常用的2A肽(P2A,T2A,E2A和F2A)中,P2A通常具有最高的切割效率(在某些情况下接近100%),接下来是T2A,其次是E2A和F2A。F2A的切割效率仅为约50%,我们通常推荐在多顺反子中使用P2A或T2A。

参考文献
参考文献 主题
Biotechniques. 41:283 (2006) Translational efficiency of EMCV IRES in bicistronic vectors
PLoS One. 6:e18556 (2011) Cleavage efficiency of 2A linkers in human cell lines, zebrafish and mice

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