哺乳动物基因普通表达质粒载体

概述

在生物医学领域,利用常规转染将质粒载体转到哺乳动物细胞中是使用最广泛的方法。虽然近年来开发了不少更为先进的基因导入载体系统(如慢病毒载体、腺病毒载体、AAV载体和piggyBac等),但常规质粒基因表达载体仍被大多数实验室使用,这主要得益于其在技术上的简便性以及在各种类型细胞中的高效转染率。常规质粒载体转染的关键特点是短暂性,并且在宿主基因组中的整合效率非常低(通常小于1%)。

关于常规质粒基因表达载体的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Mol Biotechnol. 16:151 (2000) Overview of vector design for mammalian gene expression
EMBO J. 12:2539 (1993) Transcription blocker prevent transcriptional interference

亮点

我们的载体系统已经过优化,其在大肠杆菌中具有高拷贝复制能力,且对细胞具有高效转染率。根据用户选择的筛选标记基因,可对转染了该载体的细胞进行筛选或者可视化追踪。

优势

技术简单:常规转染即可把质粒转入细胞,相比起病毒载体需要进行病毒包装,过程更简单。

载体容量非常大:我们的载体总容量可达30 kb,其中质粒骨架只占3 kb,有足够大的容量可以放置客户所感兴趣的序列。

高水平表达:常规质粒转染细胞后,可以产生非常高的拷贝数(每个细胞多达几千拷贝),使外源基因能高水平表达。

不足之处

载体DNA非整合型:常规质粒在细胞里主要以游离DNA状态存在,所以常规质粒转染也称为瞬时转染。然而,质粒DNA也可以以非常低的概率永久整合到宿主基因组中(质粒转染每102~106个细胞可能会有一个细胞的基因组被整合,整合效率取决于细胞类型)。如果将携带了药物抗性基因或者荧光标记基因的载体转到细胞中,在经过扩大和传代培养后,可以使用药物筛选或细胞分选来获得稳定整合了该载体的细胞。

可转染的细胞类型受限:不同类型细胞的质粒转染效率差异很大。非分裂细胞比分裂细胞更难转染,原代细胞比永生化细胞系更难转染。一些重要的细胞类型更是难以转染,如神经元和胰岛β细胞。另外,质粒转染局限于体外细胞实验,很少运用到活体实验。

基因拷贝数在不同细胞中呈现差异性:尽管成功的转染可以在单个细胞里产生非常高的拷贝数,但不同细胞间却有高度的差异性。在一些细胞中,质粒拷贝数非常高,而在另外一些细胞却是低拷贝甚至没有。而病毒转导更倾向于相对均匀地把基因转到细胞中。

载体关键元件

Promoter: The promoter that drives your gene of interest is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.