转染用慢病毒载体

与游离的病毒不同（例如单纯性疱疹病毒，腺病毒），逆转录病毒具有能将遗传物质整合到宿主基因组的能力，使转基因能够稳定、长期地表达。因此，简单的逆转录病毒（即所谓的γ或者致癌逆转录病毒）在当代生物医学中扮演了重要角色。但是，简单逆转录病毒不能感染非分裂细胞以及有诱发癌症的风险的这些特点限制了它们的应用。使用慢病毒能够绕过简单逆转录病毒的这些短板。慢病毒是一类复杂的逆转录病毒，除包含gag、pol和env这些简单逆转录病毒的常规基因外，还包含额外的调控基因和辅助基因。与简单逆转录病毒不同的是，慢病毒能感染分裂和非分裂细胞，大大增加了基因可转移的细胞范围。慢病毒倾向整合到染色体中的内含子区域（表达基因富含内含子），而简单的逆转录病毒则更偏好启动子和调控区域。广泛使用的慢病毒载体是通过将人类免疫缺陷病毒类型1（HIV-1）工程化而来的。

HIV-1结构

HIV-1病毒粒子大致呈球形，直径约为100 nm，外面包裹着在出芽过程中从宿主细胞衍生而来的脂质双层膜。该包膜表面携带许多小的糖蛋白凸起物。病毒通过这些糖蛋白识别新的宿主细胞。脂质层下的基质蛋白覆盖病毒包膜的内表面，形成一个保护壳。在病毒粒子的内部，是一个由结构蛋白组装成的锥形衣壳，里面装载着病毒基因组。两条长度为9.2Kb的单链RNA基因组、核衣壳蛋白、逆转录酶以及整合酶被共同装载在衣壳中。

图1. HIV-1结构

HIV-1基因组

HIV-1基因组是单组分、线性、二聚体的ssRNA（+），长度约为9.2Kb（HIV-1前病毒基因组的大小约为9.7Kb），带有5’帽子和3’poly-A尾。蛋白编码区侧翼序列为5’和3’长末端重复序列（LTR）。LTR包含3’特异元件（U3）、重复元件（R）和5’特异元件（U5），还包含一些顺式作用元件。一个病毒的RNA基因组起始于5’LTR 中R区的第一个核苷酸，终止于3’LTR中R区的最后一个核苷酸，包括了编码19种蛋白产物的9种基因。gag、pol和env基因编码所有逆转录病毒具有的常规结构蛋白和酶。其他额外的基因编码必需的调控蛋白（tat和rev基因）和辅助蛋白（vif、vpu、vpr和nef基因）。由于病毒基因组很紧凑，HIV-1通过利用宿主细胞的RNA剪接机器来表达数量众多的基因。

图2. HIV-1基因组

HIV-1生命周期

当病毒包膜上的糖蛋白gp120与宿主细胞表面的CD4受体和一个二级受体结合时，病毒开始复制。这种连续的结合触发了病毒和宿主细胞膜的融合，随后将病毒核心释放到宿主细胞的细胞质中。一旦进入，病毒衣壳遭遇“脱壳”，在此期间大多数的衣壳脱落，而核衣壳、病毒蛋白R、整合酶以及一小部分基质仍连在一起。随着脱壳过程的不断进行，病毒基因组RNA（gRNA）逆转录成互补DNA（cDNA），新合成的病毒cDNA以先导整合复合体（PIC）的形式保持与病毒和细胞蛋白的联系。当逆转录全部完成之后，一段长度约为100 nt的三链DNA（被称为中心DNA瓣）在cPPT/CT区域形成，它是病毒DNA核运输所必需的。PIC通过核孔复合体（NPC）进入细胞核内而不会破坏核膜，然而许多其他逆转录病毒则需要在有丝分裂时期借助核膜的破坏来接近宿主染色体。一旦进入细胞核内，PIC即发生解体，HIV整合酶将病毒cDNA整合到宿主细胞的基因组中。

病毒DNA整合之后，HIV前病毒能够保持转录沉默，或者激活转录进入生命周期的完成阶段。HIV基因组转录涉及RNA聚合酶II（RNAP II）与病毒蛋白Tat以及一些宿主蛋白共同合作。病毒启动子5’LTR中有能够被RNAP II激活的启动子的经典结构。在Tat缺乏的情况下，从LTR的转录启动尽管有效，但会因为启动子与进行性聚合酶结合不良以及这些酶过早的从DNA模板上脱落而导致转录受损。Tat蛋白最初是从已整合的病毒DNA表达，并且与早期的RNA转录本中的TAR发夹结构相结合，增加RNAP II的持续合成能力。病毒RNA的转录开始于5’LTR中R区的第一个核苷酸，多聚腺苷酸化发生在3’LTR中R区的最后一个核苷酸。前病毒DNA经RNAP II转录生成一条未剪接的长链RNA，既能被用作包装进病毒粒子中的gRNA，还可以作为Gag和Gag-Pol转录的转录本，或者经剪接产生超过40个不同的mRNA以被用于产生余下的病毒蛋白。HIV-1转录调控蛋白（包括Rev）由加工完全的mRNA转录本翻译而来，而结构蛋白则是由不完全剪接的转录本翻译而来。完全剪接的转录本通过与细胞内mRNA相同的机制由细胞核运输到细胞质中。一般而言，包含内含子的RNA（未剪接的或者不完全剪接）被保留在细胞核内。然而，HIV-1已经发展出了一套特别的机制，即利用Rev调控蛋白与一个结构化的顺式作用RNA元件也就是熟知的Rev反应元件（RRE）相结合来克服这个问题。

一经进入细胞质中，未剪接的gRNA采用以下两种途径中的一种：1)作为一个mRNA模板用于翻译Gag蛋白，以及通过核糖体移码翻译成Gag-Pol，以编码病毒蛋白酶、逆转录酶以及整合酶；2）作为gRNA被包装成病毒粒子。两条HIV gRNA被包装成一个二聚体，在5’末端（这些序列即为Ψ（psi），用作“包装信号”）附近以非共价连接方式结合。Ψ元件仅存在于未剪接的gRNA中。在单体gRNA中，Ψ元件被分子内碱基对隐藏起来，之后经2个拷贝的gRNA二聚化才会暴露出来，以允许未剪接的gRNA二聚体与Gag多聚蛋白的NC区特异性的、高度亲和的结合。多条Gag多聚蛋白能与gRNA的一个二聚体相互作用。该复合体被肌动蛋白或者微管运输到最终病毒粒子组装和出芽发生的细胞膜。病毒粒子一旦释放，蛋白酶被激活并将Gag和Gag-Pol裂解成单链，在病毒粒子内部自我组装形成衣壳，导致有感染性的病毒颗粒的产生。

慢病毒包装系统

通过瞬时转染编码病毒组件的质粒，重组慢病毒颗粒能够从正确包装的细胞中生产出来。慢病毒包装系统建立于一个“切割”系统，在该系统中自然的病毒基因组序列被分割后装进几个单独的辅助质粒，这样增加了慢病毒转导实验的安全性。第三代包装系统所需的元件包括：

转移载体

转移质粒表达全长的gRNA，该gRNA包含用于有效包装、逆转录、核运输和整合到宿主基因组DNA所必须的所有顺式作用元件。通常，该质粒包含一个携带由内部启动子驱动的目的基因的转基因表达盒。早期的载体包含完整的5’和3’LTR。因而转录是Tat依赖的，并且病毒能够自我复制。为了进一步提高包装慢病毒的生物安全性，不依赖Tat的病毒gRNA转录通过用一个强的异源性启动子（例如RSV启动子）替代5’LTR中U3区的增强子/启动子序列来得以实现。此外，3’LTR中的大部分U3区被删除掉。该U3缺失体在逆转录时能被复制到5’LTR，使得前病毒自我复制失效（所谓的“自我失活”）。

包装质粒

包装质粒能表达感染颗粒形成所必需（除Env之外）的病毒酶和结构蛋白。早期的第一代慢病毒载体系统的包装质粒含有辅助蛋白和调控蛋白的表达元件。为尽量减少生产和使用慢病毒载体的相关风险，所有编码辅助蛋白和与细胞毒性相关的非必需基因均被移除，第三代包装系统由此产生。在该系统中，包装元件被分隔在两个质粒中，一个Gag-Pol表达质粒和一个Rev表达质粒，尽可能的降低一个具有复制能力的慢病毒（RCL）重新形成的风险。

包膜载体

包膜载体能表达一个异源性糖蛋白，即水泡性口膜炎病毒糖蛋白(VSV-G)，该蛋白能与细胞表面广泛存在的磷脂组分而不是一个特异性的细胞表面受体相结合。此类病毒宿主细胞的范围十分广泛，包含的细胞类型例如有神经元、淋巴细胞和巨噬细胞。此外，VSV-G增加了病毒颗粒的物理稳定性，以允许使用高速离心对病毒进行浓缩。

图3. 第三代慢病毒包装系统

转染用慢病毒载体的产品规格、运输方式和储存条件在下表中列出。

• 转染用包装混合物包含了优化混合的第三代包装质粒和VSV-G衣壳表达载体。这些质粒提供辅助功能以及产生VSV-G慢病毒所必需的结构和复制蛋白。
• 转染用EGFP慢病毒载体包含一个EGFP表达盒。该表达盒能够包装进病毒颗粒，进而转导进哺乳动物细胞。利用该质粒，可实时测量转染效率和转导效率，从而优化病毒包装和细胞转导实验。
• 转染用的scramble shRNA慢病毒载体包含一个scramble shRNA表达盒和一个EGFP表达盒。这些表达盒能够包装进病毒颗粒，进而转导进哺乳动物细胞。该质粒可用作RNAi实验的阴性对照。

我们建议在实验中使用EGFP慢病毒载体作为对照组来帮助您评估实验结果。当您从我们的载体工匠网站（vectorbuilder.com）订制病毒包装服务时，即可免费获得EGFP慢病毒。

1. 转染前一天（第0天）

• 将293T HEK细胞接种在10 cm组织培养皿中，保证在转染当天细胞汇合度达到90-95%。我们建议在10 ml包含血清的生长培养基中接种5 × 10⁶个细胞。
  注意：培养基中不含抗生素。
• 保持培养皿水平的同时，前后左右地摇晃培养皿，让细胞均匀地铺满整个培养皿；在37°C，5% CO₂ 培养箱中孵育过夜。
• （可选）用多聚L-赖氨酸预处理培养皿表面以增强293T HEK细胞与培养皿之间的粘性。每个培养皿中加入10 ml 多聚L-赖氨酸，室温下孵育15分钟并弃掉液体。

2. 转染当天（第1天）

• 转染前当天观察接种的培养皿。当细胞汇合度达到90-95%时可准备转染。此时细胞之间仍有1-2次细胞分裂的空间。
• 移除培养液，替换成8 ml无抗生素的血清生长培养基。
• 在5 ml离心管中加入包装混合物和转移载体来准备质粒DNA混合物。对于10 cm的培养皿，使用15 ug转移载体和20 ug的包装混合物。
• 将转染混合物一滴一滴地加入到细胞中，铺满整个培养皿。轻柔旋转细胞，在37°C、5% CO₂ 培养箱中孵育过夜。
  注意：在5%的CO₂中孵育是必需的，这是由于转染培养基的pH会影响CaPO4沉淀物形成的效率。

3. 转染后一天（第2天）

• 观察细胞。若转移载体包含一个荧光标记（例如EGFP），则通过在荧光显微镜下观察荧光细胞来检查转染效率。通常情况下，超过90%的细胞被转染。
  注意：VSV-G糖蛋白会导致293T HEK细胞融合，而造成多核的合胞体的出现。这种形态学上的变化属于正常现象，不会影响慢病毒的产生。如果没有观察到合胞体，则病毒的产出有可能受影响。
• 移除含有转染复合物的培养基，替换成10 ml不含抗生素的完全培养基。
• 37°C、5% CO₂ 培养箱中孵育。

4. 第3-4天

• 转染后48-72小时（第3-4天），将培养基移入一个15 ml 带盖的圆锥形无菌管中，收集含有病毒的上清液。
  警告：请记住此时您正在操作有感染性的病毒。请按照BSL-2条例操作。
• 4°C、3000 rpm离心病毒上清液15分钟沉淀细胞碎片。
• 用0.45 um滤膜进一步过滤病毒上清液中的细胞碎片。初步处理后的病毒上清液可直接转导细胞，也可根据您的实验需求进一步浓缩或者纯化病毒。