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载体指南

哺乳动物基因表达VSV载体

概述

水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)载体在研究病毒颗粒入侵宿主细胞、辨认介导病毒感染细胞的细胞表面受体、筛选病毒抑制药物以及疫苗开发方面有着广泛的应用。VSV病毒载体可以高效地利用异源病毒的包膜蛋白进行假型化(Presudotypted),比如那些需要在高生物安全等级实验室操作的病毒的包膜蛋白。重组VSV在宿主细胞中不能进行超过一轮的复制,因此可以在生物安全2级(BSL2)实验室进行相关操作。这些特点促使VSV病毒载体成为在无需高度隔离下研究高风险病毒侵入细胞机制的理想选择。

野生型VSV属于弹状病毒科(Rhabdoviridae),拥有一条单链负义RNA基因组,并且其复制依赖病毒的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)。VSV的单链RNA基因组编码以下五种蛋白组分:核蛋白(N)、磷酸化蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和病毒RdRp的大亚基(L)。VSV病毒颗粒中,其RNA基因组与N核蛋白组成核糖核酸蛋白(Ribonucleoprotein,RNP)。P和L蛋白则组成RdRp,并结合于RNP。VSV感染靶细胞时,其G糖蛋白诱导细胞发生内吞作用,帮助病毒侵入细胞。G糖蛋白可以介导病毒包膜与细胞膜融合,促使RNP和RdRp一起释放到细胞质中。病毒组分进入细胞后,RdRp以RNP中的负义RNA基因组为模板立即启动一级转录,而作为转录产物的正义RNA链被进一步翻译,用于生产介导病毒基因组复制、二级转录、病毒组装和出芽等病毒等功能的后期蛋白。

载体家生产的重组VSV是G糖蛋白基因缺失的,该缺失导致VSV自我复制缺陷的。G糖蛋白基因通常被替换为报告基因(如荧光蛋白基因、荧光素酶报告基因或分泌型碱性磷酸酶基因)用于病毒的转导效果测定。生产VSV假病毒主要由三个步骤构成:1. 使用质粒初步制备VSV;2. 扩增G糖蛋白补全的VSV;3. 使用异源病毒的包膜蛋白组装VSV假病毒。进行重组VSV初步制备时,首先利用大肠杆菌构建一个可转录编码VSV基因组的负义RNA链的VSV-ΔG转移质粒,其转录产物作为RdRp合成病毒RNA的RNA模板。该载体与四个辅助载体(分别表达VSV N、P、G和L蛋白)共转染至经牛痘病毒接种的表达噬菌体T7 RNA聚合酶的包装细胞。T7 RNA聚合酶作用于转移质粒上的T7启动子,驱动VSV-ΔG基因组转录出负义RNA。重组VSV在包装细胞中组装并释放。收集细胞上清,用其再次感染表达有G糖蛋白的包装细胞,获得高产量的G糖蛋白补全的重组VSV。VSV假病毒随后通过转导G糖蛋白补全的VSV至表达有异源病毒包膜蛋白的包装细胞的方式制备。

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Hum Vaccin Immunothera. 15:2269 (2019) Recombinant vesicular stomatitis vector vaccines
Vaccine. 34:6597 (2016) Risk/benefit assessment of live viral vaccines based on VSV
Front Microbiol. 2:272 (2012) Development and applications of VSV vectors
J Virol Methods. 169:365 (2010) Generation of VSV pseudotypes using recombinant VSV-delta G
J Gen Virol. 86:2269 (2005) Generation of VSV pseudotyped with coronavirus spike protein
Virology. 286:263 (2001) Characterization of VSV pseudotyped with HCV envelop proteins
亮点

我们的VSV转移质粒删除了VSV的G糖蛋白基因,因此可通过提供异源病毒包膜糖蛋白的顺式元件来组装VSV假病毒。VSV病毒的细胞嗜性取决于其包膜蛋白的类型。经过专门优化,我们的VSV转移质粒可以在大肠杆菌中以高拷贝数方式复制,并含有报告基因以用于VSV假病毒感染靶细胞后的转导效果测定。

优势

病毒滴度高:我们的VSV载体可用于包装滴度高达>108 IU/ml 的VSV病毒。该滴度范围的VSV病毒感染体外哺乳动物细胞时,足量病毒可以获得100%的转导效率。

生产上易于扩增:重组VSV可以很方便地几乎在所有类型的哺乳动物细胞中进行扩增制备。

安全性高:重组VSV只能在宿主细胞中进行一轮复制。使用VSV假病毒可以安全地在BSL-2设施中研究高风险病毒(如伊波拉病毒、寨卡病毒、尼帕病毒、新冠病毒等)的包膜蛋白。

适用于疫苗研发:VSV可以引发体液和细胞免疫,毒性很低,并且在人类群体中只有很低的血清阳性率。重组VSV是理想的用于研制人类疫苗的病毒载体。

不足之处

载体容量有限:VSV基因组长度为11 kb,超出该尺度的长片段基因或多基因插入将降低病毒包装后的病毒滴度,不利于后续应用。

不适用于研究病毒的传染病模型:由于重组VSV只能在宿主细胞内复制一次,因此对于实际的病毒感染机体过程的反映能力相当有限。

技术复杂:生产重组VSV有相当多的中间步骤,包括从质粒初步制备VSV、斑块纯化、生产G糖蛋白补全的VSV、使用异源病毒的包膜蛋白组装VSV假病毒等。这些步骤相对于传统的质粒转染要求运用到更复杂的技术。

载体关键元件

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It can drive high-level transcription of the downstream viral antigenomic RNA in packaging cells.

T7 promoter: Promoter from T7 bacteriophage. The T7 RNA polymerase from the phage recognizes this promoter to drive high-level transcription of the downstream viral antigenomic RNA.

VSV-N: Nucleoprotein gene of vesicular stomatitis virus. Assembles into an intact RNase-resistant nucleocapsid as N/RNA polymer; required for initiating viral genome synthesis.

VSV-P: Phosphoprotein gene of vesicular stomatitis virus. Functions as a critical component of the VSV polymerase complex by positioning the large (L) protein on the N/RNA template and stimulating viral RNA synthesis with the L protein at both the initiation and elongation steps.

VSV-M: Matrix protein gene of vesicular stomatitis virus. Associates with the N/RNA nucleocapsid and facilitates virus assembly by promoting condensation of the ribonucleocapsid.

Kozak: Kozak translation initiation sequence. Facilitates translation initiation of ATG start codon downstream of the Kozak sequence.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

VSV-L: Large polymerase protein gene of vesicular stomatitis virus. Forms RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) complexes with the VSV phosphoprotein and catalyzes synthesis of the N, P, M, G, L mRNAs sequentially.

HDV: Hepatitis delta virus (HDV) antigenome self-cleaving ribozyme. This ribozyme, when present in the transcript, catalyzes the self-cleavage of the transcript in cis.

T7 terminator: Transcriptional termination signal from T7 bacteriophage. Allows transcription termination of RNA transcribed by bacteriophage T7 RNA polymerase.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation signal. Transcription driven by the CMV promoter is terminated within this sequence.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.