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载体指南

哺乳动物Cas9表达质粒载体

概述

CRISPR/Cas9核酸酶表达载体是当前几种流行的基因编辑工具之一,可以快速有效地在基因组靶序列上创造突变(其它两种常见的工具是ZFN和TALEN)。

Cas9是RNA引导DNA核酸酶,是天然原核免疫系统的一部分,赋予细菌产生对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抵抗能力。在细胞内,Cas9核酸酶与引导RNA(gRNA)形成复合物,该复合物通过与基因组中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用,gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上,然后切割基因组中的靶位点。

使用CRISPR打靶目的基因需要目标细胞同时表达Cas9和特异gRNA。这可以通过在同一个载体上共表达Cas9和gRNA,也可以通过在两个载体各上自表达Cas9和gRNA来实现。使用Cas9和gRNA两个载体分开表达的优势在于可使用不同的gRNA与不同的Cas9变体组合(如Cas9n,dCas9),从而带来更多变的实验方案。

我们的常规Cas9表达质粒载体可以直接转染哺乳动物细胞,方法如同大多数实验室的传统转染方法一样,操作上非常简便。质粒转染要注意的是,这种方法属于瞬时转染,只有极小一部分的细胞中的质粒序列会稳定整合到细胞基因组中(整合几率的典型值小于1%)。

我们提供多种版本的来源于Streptococcus pyogenes的SpCas9。这其中包括hCas9,人源化的野生型SpCas9,能有效地在靶序列制造DNA双链断裂(DSB);hCas9-DA10,核酸酶突变型的人源hCas9,只对靶序列的DNA单链造成切口;dCas9,bao'hanD10A和H840A突变,属于无核酸酶活性的SpCas9;SpCas9-HF1,亲和性强化的SpCas9;以及eSpCas9,特异性强化的SpCas9。dCas9融合转录激活结构域如dCas9/VP64和dCas9/VPR,或者融合转录抑制结构域后,如dCas9/KRAB,可分别应用于CRISPRa和CRISPRi系统。此外,我们提供的来源于Staphylococcus aureus的SaCas9,其序列要比SpCas9和来源于Acidaminococcus的AsCpf1更短(AsCpf1属于新一代CRISPR基因编辑系统。AsCpf1造成DSB时,两条DNA链上的切口位置相互错开,形成粘性末端)。

点击此处查看我们提供的Cas9类型

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Science. 339:819 (2013) Description of genome editing using the CRISPR/Cas9 system
Nat. Biotech. 31:827 (2013) Specificity of RNA-guided Cas9 nucleases
Nat. Commun. 9:1911 (2018) Review on various Cas9 variants
亮点

我们的Cas9表达载体可使用用户自定义的启动子实现Cas9蛋白的高水平表达。我们提供多种类型的Cas9蛋白以满足不同的实验需求。Cas9表达载体系统已经过优化,其在大肠杆菌中具有高拷贝复制能力,且对细胞具有高效转染率。根据用户选择的筛选标记基因,可对转染了该载体的细胞进行筛选或者可视化追踪。

优势

瞬时表达:转染Cas9表达质粒载体可以在靶细胞中获得高水平的Cas9蛋白表达瞬时峰值。在无药筛的情况下,基因编辑完成后Cas9质粒载体会逐渐从细胞中丢失。

灵活性:Cas9表达质粒载体可与多种不同的gRNA共转染至细胞中以打靶多个位点。

技术简单:常规转染即可把质粒转入细胞,相比起病毒载体需要进行病毒包装,过程更简单。

高水平表达:常规质粒转染细胞后,可以产生非常高的拷贝数(每个细胞多达几千拷贝),使外源基因能高水平表达。

不足之处

载体DNA非整合型:常规质粒在细胞里主要以游离DNA状态存在,所以常规质粒转染也称为瞬时转染。然而,质粒DNA也可以以非常低的概率永久整合到宿主基因组中(质粒转染每102~106个细胞可能会有一个细胞的基因组被整合,整合效率取决于细胞类型)。如果将携带了药物抗性基因或者荧光标记基因的载体转到细胞中,在经过扩大和传代培养后,可以使用药物筛选或细胞分选来获得稳定整合了该载体的细胞。

可转染的细胞类型受限:不同类型细胞的质粒转染效率差异很大。非分裂细胞比分裂细胞更难转染,原代细胞比永生化细胞系更难转染。一些重要的细胞类型更是难以转染,如神经元和胰岛β细胞。另外,质粒转染局限于体外细胞实验,很少运用到活体实验。

基因拷贝数在不同细胞中呈现差异性:尽管成功的转染可以在单个细胞里产生非常高的拷贝数,但不同细胞间却有高度的差异性。在一些细胞中,质粒拷贝数非常高,而在另外一些细胞却是低拷贝甚至没有。而病毒转导更倾向于相对均匀地把基因转到细胞中。

PAM序列依赖: CRISPR/Cas9靶向特定位点时对gRNA识别序列3'端的PAM序列有严格要求。不同类型的Cas9蛋白需要使用不同的PAM序列。

载体关键元件

Promoter: The promoter that drives the expression of the downstream Cas9 gene is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of the Cas9 nuclease variant chosen by the user.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.