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载体指南

哺乳动物CAR表达质粒载体

概述

利用嵌合抗原受体 (Chimeric antigen receptor,CAR) 载体生产可识别肿瘤相关抗原的工程T细胞(也称为CAR-T细胞)已成为一种极富前景的癌症治疗工具。在 CAR-T细胞免疫疗法中,来自患者(自体)或健康供体(同种异体)的T细胞经过改造表达CAR。CAR受体可以靶向识别肿瘤细胞表面抗原,活化T细胞使其发挥免疫作用以帮助杀伤肿瘤细胞。

CAR受体的结构由四个主要部分组成:(1)一个胞外抗原识别结构域,由已知特异性的抗体的单链可变区片段 (Single chain variable fragment,scFv) 组成。 scFv促进抗原结合,包含一个轻链可变区片段和一个特异的单克隆抗体的重链片段,两者通过一个柔性的肽链相连;(2)一个位于胞外的铰链区或间隔区,将scFv与CAR的跨膜结构域连接起来,并为CAR的结构提供灵活性和稳定性;(3)跨膜结构域,将CAR锚定在质膜上,从而将胞外的铰链区和抗原结合结构域同细胞内结构域关联起来。它在增强受体表达和稳定性方面起着关键作用;(4)胞内信号域,通常源自T细胞受体的CD3 zeta链并包含免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)。抗原结合CAR后,ITAM被磷酸化并激活下游信号传导,从而导致T细胞的后续活化。此外,该胞内结构域还可以引入一个或多个与CD3 zeta信号域串联的共刺激域(来源于CD28、CD137等),以改善T细胞增殖效率和活化的持久性。

CAR的结构在过去几年中随着对胞内结构域的修改而不断发展。第一代CAR仅包含一个衍生于CD3 zeta链的信号域。虽然这种CAR可以激活T细胞,但是由于表达此类CAR的T细胞的细胞毒性和增殖能力偏低,它们在体内的抗肿瘤活性并不理想。第二代CAR除了包含一个CD3 zeta信号域,还具有一个胞内的共刺激域,因此表达第二代CAR的T细胞显著改善了其体内增殖能力、扩增能力和活化的持久性。为了进一步优化 CAR T细胞的抗肿瘤功效,第三代CAR除了CD3 zeta外,还引入了两个胞内顺式作用的共刺激结构域。此后,通过修饰胞内结构域以进行诱导表达或组成型表达细胞因子,第四代CAR从第二代CAR开发获得。第五代和最新一代CAR也是从第二代CAR衍生而来,整合了细胞因子受体的胞内结构域。

我们的CAR表达质粒载体非常适合非病毒的第二代CAR表达盒转染T细胞。整个CAR 表达盒包括scFv区、铰链区、跨膜结构域和胞内CD3 zeta信号域以及共刺激域,均位于用户选择的启动子下游。用常规质粒载体转染的一个关键优势是它是瞬时转染的,只有非常少的质粒会稳定整合到细胞基因组中(通常小于1%)。

有关此载体系统的更多信息,请参阅以下文献。

参考文献 主题
Br J Cancer. 120:26 (2019) Review on next-generation CAR T cells
BMC Biotechnol. 18:4 (2018) Optimizing DNA electroporation for producing engineered CAR T cells
Mol Ther Oncolytics. 3:16014 (2016) Review on CAR models
J Immunother. 32:689 (2009) Construction and pre-clinical evaluation of an anti-CD19 CAR
Mol Ther. 17:1453 (2009) In vivo characterization of chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains
亮点

我们的CAR表达质粒载体适用于第二代CAR的瞬时表达,并且经过特殊优化,在大肠杆菌种具有很高的拷贝数。通过质粒上的自定义标记基因用户可以方便地观测转染效果。

优势

技术简单:对比病毒转导,CAR表达质粒载体通过电转染法转染T细胞是一种较为简单的技术。病毒载体的病毒包装过程耗时且技术上具有相当挑战性。

安全:CAR表达质粒载体转染至细胞后为瞬时表达,不整合细胞基因组,因此对比逆转录病毒类的载体不会产生显著的插入突变风险。

大装载量:我们的载体大小可达30 kb,而载体骨架只占有3 kb,因此留有相当多的空间用于CAR表达盒的设计,比如加入启动子、标记基因以及额外的目的基因等。

低成本:生产临床级别的质粒载体比病毒载体可以减少相当多的成本,使用CAR表达质粒载体制备用于临床研究的CAR T细胞具有很高的性价比。由于CAR T细胞的临床效果根据临床前的小鼠上的实验效果进行预测,因此在临床研究中也需要使用CAR T细胞进行研究。

不足之处

递送方式:CAR表达质粒载体通过电转染法转染T细胞只能对低至中等数量的细胞成功递送CAR表达盒。此外,电转染法对T细胞有潜在的毒性,可能会减少具有功能的CAR T细胞的产量。因此有可能需要在体外延长细胞的培养时间以达到灌注的细胞数量要求,而过长时间的培养也会导致细胞表型的改变与T细胞长期记忆功能的减弱。

载体DNA非整合性:质粒载体转染至细胞后主要以游离体形式的DNA存在,只有很低的频率(102~106分之一,取决于细胞类型)会整合基因组。如果载体上带有药筛标记或者荧光标记,基因组整合型的载体有利于长周期细胞培养后的细胞筛选。

载体关键元件

Promoter: The promoter driving your CAR expression cassette is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

CD8-leader: Leader signal peptide of T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain. Directs transport and localization of the protein to the T-cell surface.

scFv: Single chain variable fragment derived from a monoclonal antibody of known specificity. Recognizes cells in an antigen-specific manner.

Hinge: Extracellular hinge region of the CAR. Connects scFv with the transmembrane region providing stability and flexibilty for efficient CAR expression and function; enhances efficiency of tumor recognition; improves expansion of CAR-T cells.

Transmembrane domain: Transmembrane domain of the CAR. Anchors the CAR to the plasma membrane and bridges the extracellular hinge as well as antigen recognition domains with the intracellular signaling region; enhances receptor expression and stability.

Costimulatory domain: Intracellular costimulatory domain of the CAR. Improves overall survival, proliferation, and persistence of activated CAR-T cells.

CD3zeta: Intracellular domain of the T cell receptor-CD3ζ chain. Acts as a stimulatory molecule for activating T cell-mediated immune response.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream CAR expression cassette.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.