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常见问题
VECTOR FAQ

为什么我的原核表达载体没有表达目的蛋白?

表达菌株不合适

表达载体在不适当的宿主菌株中可能无法进行诱导表达。VectorBuilder大多数载体的克隆宿主菌株都是Stbl3(具体详看载体报告)。Stb13能够保持质粒的稳定性,是优选的克隆宿主,但它可能不适用于重组蛋白表达。例如,对于pET载体,IPTG诱导的重组蛋白表达需要含有T7 RNA聚合酶的宿主菌株,而Stbl3却没有。因此,原核细菌表达载体通常需要将质粒转移到合适的宿主菌如BL21(DE3)中进行诱导表达。

载体上表达的蛋白“有问题”

有时候,当表达的蛋白是非溶性的,或折叠错误,不当切割或对细菌宿主有毒性时,目的蛋白往往不能正常诱导表达。在这种情况下,您需要优化诱导条件(详见下文),或者替换成更耐受的宿主菌株或更换表达载体类型。

诱导条件有待优化

根据待表达基因,表达载体和宿主菌株等因素,您可能需要考虑优化以下诱导条件:OD600(通常为0.6-0.8);诱导剂(如IPTG或L-阿拉伯糖)的浓度不能太低或太高;诱导持续时间不能太短或太长;诱导温度,特别是在处理“有问题”蛋白时(见上文),可以测试不同的温度梯度(如16°C,25°C,30°C,37°C等)。在极少数情况下,由于原因不明,相同表达载体的不同克隆可能会表现出不同的表达能力,因此您可能需要挑选多个单菌落进行单独测试,以筛选出具有最佳诱导效果的克隆。

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