重组蛋白原核IPTG诱导表达载体pET

概述

pET载体系统是用于在大肠杆菌中表达重组蛋白的功能强大且广泛使用的系统,载体上的噬菌体T7强启动子能够调控目的基因的转录和翻译。细胞内存在T7 RNA聚合酶时,重组蛋白的表达被激活。当处于完全诱导状态时,几乎所有细胞资源都会致力于表达目的蛋白,仅需几个小时的诱导,目的蛋白的表达量就可以占细胞总蛋白的一半。

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Methods Enzymol. 185:60-89 (1990) Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes.
J Mol Biol. 219:45 (1991) Development of the T7lac promoter system.

亮点

首先,在缺乏T7 RNA聚合酶基因的宿主菌中,将目的基因克隆到pET载体上,这样可以以防止重组毒性蛋白的表达引起的质粒不稳定性。之后,重组蛋白可以通过两种方式表达:一种是将携带T7 RNA聚合酶基因的噬菌体(例如λCE6噬菌体)感染宿主菌;更常见的另外一种是将pET质粒转移到由LacUV5启动子驱动T7 RNA聚合酶基因表达的细菌宿主菌中,通过向菌液中加入乳糖类似物IPTG来诱导T7聚合酶的表达。

pET载体在宿主大肠杆菌中以低拷贝质粒存在,可减少诱导前的泄漏表达。该载体利用T7lac启动子系统对基因表达进行严格调控。T7启动子可以被T7 RNA聚合酶作用以驱动目的基因的高水平表达。但在T7启动子正下游有一个lac操纵子(LacO)序列,它可以与lac阻遏蛋白(LacI)蛋白作用以阻断T7启动子的转录。pET载体上携带有LacI的天然启动子和编码序列。LacI蛋白可以作用于宿主细胞中的LacUV5启动子,以抑制宿主菌合成T7 RNA聚合酶;也作用于pET载体上的T7lac启动子,以阻断抑制由于T7 RNA polymerase的泄漏表达引起的目的基因的转录。IPTG可以阻断LacI的抑制作用,从而诱导T7 RNA聚合酶和目的基因的表达。

尽管pET是高水平重组蛋白表达系统,但也可通过减少IPTG的用量来调控降低表达水平,这对于表达可溶性低的蛋白是非常有利的。另外,当T7 RNA聚合酶不存在时,目的基因可以维持在转录沉默状态。

所有定制的pET载体都会克隆在缺乏T7 RNA聚合酶基因的大肠杆菌中(如Stbl3),以最大程度地降低质粒的不稳定性。对于重组蛋白生产,我们推荐将载体转移到BL21(DE3)或HMS174(DE3)宿主菌中,这些菌株的基因组携带了由LacUV5启动子驱动的T7 RNA聚合酶基因。如果目的基因表达毒性蛋白,则建议使用携带pLysS或pLysE质粒的宿主菌,这些质粒通过产生T7溶菌酶(T7 RNA聚合酶抑制剂)来抑制目的基因的本底表达。

优势

表达水平高:T7转录和翻译调控系统能使目的蛋白高水平表达。通常情况下,重组蛋白的表达量可达到总蛋白量的50%。

表达严谨:在没有添加IPTG的情况下,目的基因的表达通常会被强烈抑制。在大多数宿主菌株中,目的基因的这种“关闭”状态非常稳定,且适用于大部分基因。

不足之处

宿主要求:pET载体应保存在缺乏T7 RNA聚合酶基因的大肠杆菌中,须转移至携带T7 RNA聚合酶基因的宿主菌中诱导目的蛋白的表达。

潜在泄漏表达:在某些表达宿主菌株中,即使没有IPTG,T7 RNA聚合酶也会低水平表达,使得某些目的基因泄露表达从而引起细菌毒性反应。

载体关键元件

T7 promoter: Drives high-level transcription of the gene of interest when T7 RNA polymerase is present. When placed immediately upstream of a LacO element, the entire cassette is known as the T7lac promoter.

LacO: Binding site for LacI. This element inhibits activity of the T7 promoter when LacI protein is present, preventing leaky expression of the gene of interest.

RBS: The ribosome-binding site and translation initiation element from T7 bacteriophage. This allows for efficient production of the protein of interest.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

T7 terminator: Signal sequence to terminate the transcript made from the gene of interest, preventing run-on transcription.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pBR322 ori: pBR322 origin of replication. Plasmids carrying this origin as well as the Rop gene exist in low copy numbers in E. coli.

Rop: Repressor of primer. It encodes a small protein that regulates plasmid copy number. The presence of the Rop protein, in combination of pBR322 origin of replication on the plasmid, results in low copy numbers of the plasmid.

LacI: The E. coli natural promoter and coding sequence for the lac repressor. In the absence of induction of the system (i.e. without IPTG), the LacI protein represses transcription of the gene of interest from the T7lac promoter, as well as transcription of T7 RNA polymerase from the LacUV5 promoter in host strains used for recombinant protein production.