为什么我的质粒提取产量这么低?
质粒上的复制起点属于低拷贝型

质粒的拷贝数是由质粒上的复制起点决定的,有的复制起始点属于低拷贝型。请确认质粒上复制起点类型。对于低拷贝质粒,则需要扩大细菌培养量以获得足够的质粒DNA。

进一步了解VectorBuilder不同载体复制起点拷贝数

用于质粒提取的菌量过少

请检查确认质粒制备柱的结合容量以及您的质粒是高拷贝还是低拷贝质粒。对于小量提取,我们建议您收集1-5 ml过夜培养菌液。对于大量提取,如果质粒是高拷贝,我们推荐使用100-150 ml过夜培养菌液;如果是低拷贝,我们推荐使用300-500 ml过夜培养菌液。一般情况下,对于高拷贝质粒,1 ml的过夜培养菌液可以小量提取〜5 ug的质粒DNA,150 ml的过夜培养菌液可以提取〜500 ug的质粒DNA;对于低拷贝质粒(如pET),1 ml过夜培养菌液可以小量提取1.5-2.5 μg质粒DNA,150 ml过夜培养菌液可以提取150-200 μg质粒DNA。

只有小部分菌体含有质粒

有的抗生素,尤其是氨苄青霉素,在液体培养中会快速降解,导致不含质粒的细菌可以大量繁殖,最终使得质粒制备产量低。为了避免这种情况,请在使用前新鲜制备含氨苄青霉素的生长培养基,并确保提供足够的浓度。另外,在培养具有氨苄抗性的细菌时,请不要让菌液饱和培养时间过长。因为随着培养时间的增加,培养基的抗生素会越来越少,许多细菌细胞也已死亡且它们所含的质粒DNA会被降解,所以从过饱和培养的菌液中提取的质粒DNA产量会低。请从新鲜菌液提取质粒DNA,如果不能立即进行质粒制备,则可以将菌体离心沉淀,并储存于-80°C冰箱中备用。

直接取甘油菌进行接菌培养

直接将从VectorBuilder收到的甘油菌或穿刺菌进行接种,可能会偶尔出现质粒制备产量低的情况。我们建议先在含有适当抗生素的LB平板上划线,然后挑取单菌落接种到含有相应抗生素的新鲜液体培养基中。具体操作说明请在菜单栏“学习中心”>“资料下载”> “甘油菌”进行查看。

没有正确使用质粒提取试剂盒

请在使用前仔细阅读质粒制备试剂盒使用说明书,防止不当操作。

质粒制备柱质量较差

某些品牌的质粒DNA制备柱质量较差,请及时检测更换相应试剂盒。