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常见问题
VECTOR FAQ

为什么我测定的病毒滴度与商家测定的不一致?

不同人测定的病毒滴度往往不完全相同,可能是测定方法不同引起的,也可能是病毒降解引起的。我们采用不同的方法测量不同类型的病毒的滴度,详情请阅读“VectorBuilder是如何测定病毒滴度的?”

如果您测定的病毒滴度与我们测定的结果差别明显,有可能是采用了不同的分析方法。例如,我们采用p24 ELISA法测定慢病毒滴度,而一些实验室喜欢采用更经济的测定慢病毒的RNA的qPCR方法。有些实验室也喜欢采用更为直接的方法,例如FACS或定量菌落形成单位法。不同的测定方法各有利弊,得到的慢病毒滴度值也各不相同。

即使采用相同的方法,由于其他因素的影响,病毒滴度也会而存在差异,比如不同的实验模型、采用不同的试剂或者实验室所用仪器的灵敏度问题等。一些常见例子,如Polybrene在慢病毒转导实验中的不恰当使用(Polybrene可能对某些细胞类型有毒性),或者所使用的细胞或者物种不能被病毒有效感染。另一类潜在问题是试剂或者检测仪器(例如,显微镜)的灵敏度不足以鉴定单个病毒的整合事件,导致病毒滴度被低估。个别情况是滴度测定方案中一些小的技术细节也会对病毒滴度值产生很大的影响。例如,AAV滴度测定通常采用qPCR方法,主要原理是对病毒液中病毒基因组的拷贝数进行定量检测,qPCR引物靶 位点的选择对于精确评估AAV滴度非常关键。在我们的AAV滴定方法中,qPCR引物被设计在AAV ITR元件上,这是业界最普遍的做法。使用ITR特异性引物测定的病毒滴度与使用靶向其他位置的引物(比如在ITR之间的区域的引物)测定的结果差异会很大,这是由于病毒ITR本身序列和位于ITR之间的序列在扩增效率上存在差异,这种差异是由ITR存在二级结构 引起的。另外,引物退火条件(例如,退火的温度和退火效率)也被发现会影响AAV的滴度值。

除滴定方法外,病毒对于保存和操作条件的敏感度也会带来滴度测定的差异。包膜病毒在反复冻融或者储存温度高于-80°C条件下能快速丧失感染能力。病毒保存液若含有破坏核酸或者影响蛋白结构的成分(例如洗涤剂和核酸酶),都会降低病毒的感染效率。此外,病毒的纯度也被认为对病毒的稳定性有影响。与慢病毒相比,AAV和腺病毒稳定性更好,尽管如此,非纯化的AAV和腺病毒被发现有被蛋白酶降解的嫌疑,因此反复冻融会表现出更低的滴度。

如果您打算在您的研究中使用病毒,我们强烈建议您在自己的实验模型中对病毒进行检测和优化,以更好的展示出每种病毒系统在您研究的特定条件下的表现。