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常见问题

VectorBuilder是如何测定病毒滴度的?

收取病毒颗粒后,如果病毒载体携带荧光报告基因,我们通常首先将病毒转导一些常见的细胞系(如293T和293A细胞),观察荧光蛋白的表达来检测病毒的质量。然后,根据不同的病毒类型使用不同的方法来定量测定病毒滴度。有时如果荧光观察和定量测定的结果存在较大差异,我们将重新测定或额外进行验证,以确保VectorBuilder包装的病毒是高质量的。

慢病毒

为了测定慢病毒的滴度,我们使用系列稀释的慢病毒转导293T细胞,然后使用qPCR的方法来定量测定每个宿主细胞基因组(使用BMP2拷贝数作为内参)中病毒基因组(使用WPRE拷贝数作为参照)整合的平均拷贝数。这种方法能够测定病毒的功能滴度,精确地反映出具有感染能力的病毒颗粒的数量。另外,还有其他测定病毒滴度的方法,其中一种是对病毒基因组RNA直接进行RT-qPCR来测定,但这种方法会严重高估病毒的滴度(通常约10倍,有时高达100倍),因为它测量的是所有病毒的基因组,包括无活性的病毒颗粒。由于慢病毒本身的不稳定性,如果病毒不储存于-80℃或被反复冻融,都会使得无活性病毒颗粒增加。另一种方法是基于病毒载体上携带的荧光或药物筛选标记的表达量来测定转导细胞的数量。该方法可能会严重低估病毒滴度,因为荧光或药物筛选标记可能由于沉默或其他原因未能在一些宿主细胞中被检测到,而有的细胞可能会被多个病毒颗粒感染。

腺病毒

对于腺病毒,我们同样会测定功能滴度。将经过一系列稀释的腺病毒转导293A细胞后,我们使用一种基于免疫组化的方法,通过检测腺病毒特异性六邻体蛋白来计算出被成功转导的细胞,每一个被免疫组化染色的细胞被视为一个转染单元。以非常低的感染复数(MOI)感染细胞,以确保大多数被转导的细胞被单个病毒颗粒感染。该测定方法与常规空斑测定具有良好的相关性。对于超纯化腺病毒,我们直接测量病毒颗粒的光密度(使用OD260)来预估病毒的滴度,因为超纯化腺病毒的光密度与功能性滴度之间存在紧密相关性。腺病毒具有非常高的稳定性,可以在室温下放置数天还能保持功能活性。

腺相关病毒(AAV)

我们通过直接从裂解的病毒颗粒中提取病毒基因组来测定AAV的滴度,使用qPCR来精确定量病毒基因组的拷贝数(使用ITR区域的拷贝数作为参照)。腺相关病毒颗粒是非常稳定的,可以在室温下放置数天还能保持功能活性。因此,腺相关病毒的滴度尽管不是以细胞转导的方式测定,但是也非常接近其实际功能滴度。

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