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常见问题

VectorBuilder是如何测定病毒滴度的?

收取病毒颗粒后,如果病毒载体携带荧光报告基因,我们通常首先将病毒转导一些常见的细胞系(如293T和293A细胞),观察荧光蛋白的表达来检测病毒的质量。然后,根据不同的病毒类型使用不同的方法来定量测定病毒滴度。有时如果荧光观察和定量测定的结果存在较大差异,我们将重新测定或额外进行验证,以确保VectorBuilder包装的病毒是高质量的。

慢病毒

我们使用p24 ELISA法测定慢病毒滴度。该方法的三明治免疫试验可测定HIV-1 核心蛋白p24在慢病毒上清液中的含量水平。我们首先在微量滴定板上加入慢病毒样本,然后每孔加入HIV-1 p24捕获抗体进行孵育,并随后添加生物素化的p24二抗以结合p24一抗。此后,样本中加入的辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素可特异性结合生物素化的p24二抗。在最后一步中,加入辣根过氧化物酶底物反应液,经HRP催化产生有颜色的产物。每个孔的颜色深度最终反映了慢病毒样本中的p24含量。使用分光光度计测量的样本吸光度数值与重组HIV-1的 p24标准曲线进行对照,然后被换算为对应的慢病毒滴度。

腺病毒

对于腺病毒,我们同样会测定功能滴度。将经过一系列稀释的腺病毒转导293A细胞后,我们使用一种基于免疫细胞化学的方法,通过检测腺病毒特异性六邻体蛋白来计算出被成功转导的细胞,每一个被免疫组化染色的细胞被视为一个转染单元。以非常低的感染复数(MOI)感染细胞,以确保大多数被转导的细胞被单个病毒颗粒感染。该测定方法与常规空斑测定具有良好的相关性。对于超纯化腺病毒,我们直接测量病毒颗粒的光密度(使用OD260)来预估病毒的滴度,因为超纯化腺病毒的光密度与功能性滴度之间存在紧密相关性。腺病毒具有非常高的稳定性,可以在室温下放置数天还能保持功能活性。

腺相关病毒(AAV)

我们通过直接从裂解的病毒颗粒中提取病毒基因组来测定AAV的滴度,使用qPCR来精确定量病毒基因组的拷贝数(使用ITR区域的拷贝数作为参照)。腺相关病毒颗粒是非常稳定的,可以在室温下放置数天还能保持功能活性。因此,腺相关病毒的滴度尽管不是以细胞转导的方式测定,但是也非常接近其实际功能滴度。

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