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常见问题

我应该使用CRISPR还是TALEN技术进行基因组编辑?

CRISPR和TALEN技术都已成功应用于体外细胞培养和模式动物,两者都可以用来进行基因敲除、点突变或者片段敲入,但方法各异且各有优缺点。

作用机制
  • CRISPR

    CRISPR系统利用位点特异性的引导RNA(gRNA)使Cas9核酸酶靶向切割基因组DNA形成双链断裂。靶向序列长度通常约为20 bp,即便是含有几个错配碱基也可以被识别和切割。

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  • TALEN

    TALEN系统使用一对嵌合蛋白,每个嵌合蛋白由FokI核酸酶结构域和TAL DNA结合结构域(识别特异性序列)组成。这对蛋白可以结合基因组中的一对靶位点,每对约18 bp,中间间隔区为14-20 bp。一旦结合DNA,这对蛋白上的Fokl核酸酶结构域可以形成二聚体,继而导致在两个靶位点之间的间隔区内产生DNA切割。

靶向效率

CRISPR和TALEN介导的基因组编辑技术都具有良好的效率,但是效率会因应用类型、物种和细胞类型不同而异。一般而言,CRISPR比TALEN能更有效地诱导DNA切割。

脱靶效应

CRISPR gRNA靶向序列大约为20 bp,而TALEN对结合的靶序列总共约36 bp。此外,Cas9/gRAN复合物对序列错配具有更高的耐受性(高达5 bp)。因此,TALEN介导的切割比CRISPR具有更高的特异性,在基因组中产生脱靶切割的可能性极低。相反,尽管CRISPR介导的敲除小鼠有较低的脱靶频率,但是在细胞系中已经有关于CRISPR脱靶效应的报道。通过使用与双gRNA配套的Cas9缺刻酶(Cas9突变体,仅含有一个催化核酸酶结构域,比如Cas9_D10A和Cas9_H840A),可以在紧靠靶区域附近产生两个单链DNA缺刻,在靶区域内产生双缺刻DSB(双链断裂),这些缺刻会被重新修复。双gRNA将靶序列扩展至约40 bp,从而使脱靶效应最小化。

靶点要求

基因组中几乎所有序列都可以作为TALEN靶位点。相比之下,CRISPR靶位点的选择受gRNA靶序列3'末端PAM序列(通常为NGG)的限制。对于基因敲除来说,这并不是障碍,因为基因中会有多个潜在有效的靶位点。但是,在基因的特定位置产生特异性的突变或者插入则存在一定的影响。为了使用CRISPR精确编辑基因组中的特定位点,可以将同源重组Donor载体或含有预期编辑序列和同源臂的长寡核苷酸,与gRNA和Cas9一起转运至细胞中,以便在靶位点处指导HDR(同源定向修复)介导的DNA修复。

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简易性

在简易性方面,与TALEN相比,CRISPR有几个方面的优势。首先,载体构建方面,CRISPR系统仅需构建短gRNA,因为Cas9/gRNA复合物的靶向依赖于简单的RNA/DNA杂交,而TALEN系统需要重新设计每个蛋白-DNA相互作用独特的TAL DNA结合结构域。TALEN每个靶位点总是需要两个载体,因此,gRNA比TALENs更便宜且更容易设计和构建。不过,TALEN预制识别模块(如VectorBuilder系统中内置的模块)能够大大减少构建TALEN载体的工作。其次,对于一些应用,如注射小鼠胚胎,Cas9蛋白和gRNA可以通过直接注射,但TALEN不能。第三,CRISPR能够广泛应用于遗传筛选实验,可以高通量地轻易构建数千种不同的gRNA以形成CRISPR筛选文库。