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病毒指南

慢病毒体内应用

背景

在过去的几十年间,HIV-1依赖的有缺陷的慢病毒已经成为目前应用最广泛的基因转移载体之一。慢病毒是一种含有二倍体正链RNA基因组的包膜病毒。一经感染宿主细胞,该病毒即利用反转录酶将其RNA转录成双链DNA,随后永久的整合到宿主细胞的染色体中。

修饰后的慢病毒已被移除所有的病毒结构基因,仅保留LTR序列和包装信号以用于导入治疗基因,仍然具有细胞感染能力。不过产生新的病毒颗粒所需的病毒基因不复存在。为提高病毒安全性,转移载体3’LTR也存在缺失,保证病毒整合后仍保持“自身灭活”(SIN)。

重组慢病毒最具优势的特征在于能够有效调控基因物质在分裂细胞和不分裂细胞中的转导、整合以及长期表达。先导整合复核体(PIC)能够允许慢病毒通过核孔复合体(NPC)来跨越核膜,提升慢病毒感染非分裂细胞的能力。其他大多数的反转录病毒则需要在有丝分裂期核孔破裂时达到宿主的核染色质。由于大多数的细胞类型在体内被认为是静止的,因此重组慢病毒成为了许多体内应用的选择。再者,与腺病毒不同的是,慢病毒在体内不具有免疫原性。

CD4是与自然的HIV包膜糖蛋白结合的主要受体,因此慢病毒载体的靶向性十分受限。CD4受体仅仅位于免疫细胞的表面。为感染不表达CD4的细胞,载体通过水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)假病毒化,VSV-G作为一种棒状病毒包膜蛋白能够与细胞质膜表面广泛存在的磷脂组分而不是某些特异细胞表面受体相结合。这类病毒均具有广泛的宿主细胞范围,包含神经元细胞、淋巴细胞以及巨噬细胞等细胞类型。而之前,反转录病毒是不能被用于这些细胞类型的。再者,慢病毒载体已被证明能在体内有效转导脑、肝脏、肌肉以及视网膜。

一个慢病毒颗粒通过细胞表面结合进入宿主细胞。释放病毒RNA基因组并反转录合成DNA。随后DNA通过病毒整合酶随机整合到宿主基因组中。

图1. 慢病毒转导机制的简要示意图

交付内容

下表为定制化慢病毒产品的交付内容。可在相应COA(Certificate of analysis document)文件查看病毒滴度。

产品类型 交付内容 产品规格 应用范围
小规格包装 定制病毒 浓缩病毒(>108 TU/ml, 10×25 µl, HBSS保存液) 体外培养细胞
对照病毒 浓缩病毒(>108 TU/ml, 1×100 µl, HBSS保存液)  体外培养细胞
Polybrene 5 mg/ml,溶于无菌去离⼦⽔,200 µl  ——
中规格包装 定制病毒 超纯化病毒(>108 TU/ml, 10×100 µl, HBSS保存液) 体外培养细胞
对照病毒 超纯化病毒(>108 TU/ml, 2×100 µl, HBSS保存液)  体外培养细胞
Polybrene 5 mg/ml,溶于无菌去离⼦⽔,200 µl  ——
大规格包装 定制病毒 浓缩病毒(>109 TU/ml, 10×100 µl, HBSS保存液) 体外培养细胞
对照病毒 浓缩病毒(>108 TU/ml, 2×100 µl, HBSS保存液)  体外培养细胞
Polybrene 5 mg/ml,溶于无菌去离子水, 200 µl  ——
中规格包装和超纯化 定制病毒 超纯化病毒(>109 TU/ml, 10×50 µl, HBSS保存液) 动物体内
对照病毒 超纯化病毒(>109 TU/ml, 10×50 µl, HBSS保存液)(选购)  动物体内
Polybrene 5 mg/ml,溶于无菌去离子水,200 µl  ——
大规格包装和超纯化 定制病毒 超纯化病毒(>109 TU/ml, 10×100 µl, HBSS保存液) 动物体内
对照病毒 超纯化病毒(>109 TU/ml, 10×100 µl, HBSS保存液)(选购)  动物体内
Polybrene 5 mg/ml,溶于无菌去离子水,200 µl  ——

* 表格所示产品规格适用范围为一般慢病毒载体。

若病毒被用于体外细胞培养,则无需进行超纯化处理。若被用于体内研究(即动物研究),则必须进行超纯化处理以去除有缺陷的病毒颗粒、细胞碎片以及少量的培养基,这些污染物会引起强烈的免疫反应。此外,超纯化可将病毒浓缩到体内注射的适宜浓度。

接收病毒后的处理

1. 慢病毒产品使用干冰冷藏运输。收到病毒后,可直接放置-80°C冷冻保存至少6个月,也可放置-20°C冷冻保存一周。将Polybrene放置-20°C冷冻保存,也可放置4°C保存两周。

2. 使用前,将病毒液放置冰上进行融解。实验过程中,亦需保持冰上放置。慢病毒在高温条件下失活较快。

3. 若实际用量较少,可将融解的慢病毒小量分装多管,再放置-80°C冷冻保存。但需要注意的是,每一次冻融都会导致滴度下降(约20%)。

注意:应避免反复冻融,以免造成滴度大幅降低。

安全须知

所有VectorBuilder的慢病毒载体均是自我失活型,这意味着被感染的细胞不能复制出新的病毒颗粒。这是由于病毒中的基因组缺失了病毒复制相关基因导致的。尽管如此,慢病毒本身具有转导人原代细胞的能力,理论上仍有生物危险的风险。我们建议按照BSL-2规范(Biosafety Level-2,二级生物安全防护水平)对慢病毒进行操作。所有的操作、储存以及生物废料的处理均需依照公共发布的和所处机构制定的规范条例。

啮齿动物大脑定点注射方案

示踪物或者工程化病毒在啮齿动物脑内的注射,通过靶向大脑特定局域显著增强了我们对神经系统的理解。这些技术目前已被普遍应用于神经系统科学。 计划使用慢病毒进行脑内注射时,需要考虑的一个重要方面是病毒颗粒在大脑包外细胞空间(ECS)中的扩散程度。脊椎动物中枢神经系统细胞间的ECS被估测<40 nm。AAV病毒直径约为20 nm,与之不同的是,慢病毒颗粒则要大的多(直径接近100 nm),颗粒大小可能极大的限制了它们在大脑中的自由扩散。 为判断研究中最适的注射量,您需要使用报告慢病毒(如表达EGFP的慢病毒)在实验动物中进行预实验。

材料

1. 试剂

  • 超纯化慢病毒(推荐病毒滴度为>1×109 个感染颗粒/ml)
  • 小鼠或者大鼠
  • 消毒剂(70%乙醇)
  • 麻醉剂和止痛剂(例如氯胺酮等)
  • 润滑剂眼药膏
  • PBS
  • 骨蜡

2. 设备

  • 电动剃须刀
  • 外科手术工具,包括小外科手术刀和剪刀,精细钳子和手术钩
  • 小动物脑立体定位仪
  • 解剖显微镜
  • 棉签
  • 带小型牙钻的手持钻机
  • 10 ul注射器+33 guage针头
  • 10 ul注射器+27 guage针头
  • 手术缝合线
  • 可温控鼠笼
  • 电热毯
操作流程

1. 麻醉

  • 给动物称重,确定所用麻醉剂剂量。例如氯胺酮-甲苯噻嗪混合物,成年小鼠以及大鼠用量通常为每千克体重80~10mg氯胺酮和10 mg甲苯噻嗪。
  • 通常使用腹腔注射法麻醉动物。
  • 将实验动物放置在电热毯上以维持体温稳定。
  • 实验动物需在10分钟内进入深度麻醉。通过夹鼠尾方法检测动物对刺激的反应以确定麻醉深度。

2. 动物准备

  • 刮掉头盖骨上的毛发
  • 用70%乙醇擦拭皮肤
  • 手术中使用润眼膏避免角膜炎
  • 用镊子拔出舌头以促进呼吸

3. 动物固定

  • 为将动物固定在脑立体定位仪中,在脑立体定位仪上安装一个耳棒,温柔地牵引动物头部以将其耳道放在耳棒之上,保持动物的头部位置,随后缓慢放置好第二根耳棒以完成固定。
  • 缓慢地将门牙适配器放入动物嘴里,直到动物的门牙被嵌入适配器开孔中,之后轻柔的将适配器拉回并固定到位。
  • 鼻夹是动物的最后一个固定点,需要轻压在动物鼻子上。

图2. 动物固定示意图

4. 开颅手术

  • 用一把小手术刀或者手术剪在动物中线位置做切口。分离皮肤和肌肉组织并用小的手术钩将该部位撑开。
  • 用棉签清理头盖骨表面直到前卤和λ区清晰可见。
  • 用门牙适配器的螺钉调整动物头部位置,以保证动物头骨前端处于水平。
  • 采用立体定位法,沿着三个轴向,分别从注射器前端开始直到前囱点。标记下坐标轴,该点即为三个坐标轴的零点。
  • 压低注射器尖端直至其接触到头盖骨,用记号笔做好标记。移走注射器以免造成损伤。
  • 利用手持钻机,采用轻微的下压方式,削薄头盖骨靶位点区域(一个注射位点约1 mm×1 mm)。在打磨过程中,我们通常会使用40倍解剖显微镜。当头骨很薄时则停止打磨(此时脑膜血管清晰可见)。
  • 用一个小针头(27 guage)仔细地在手术切口边缘穿孔。之后,用针头尖端将变薄的头骨翻开后用精细的镊子小心取出。用于注射的针头能够轻易的插入小鼠以及年轻大鼠的头骨的硬脑膜中,因此无需把硬脑膜打开。
  • 用PBS保持暴露出的头骨和硬脑膜湿润。

图3. 小鼠头骨立体定位

5. 慢病毒注射

  • 吸取所需体积(一般4 ul)的慢病毒溶液。
  • 将注射器放置在洞口上方,缓慢地垂直下移注射器直至触到头盖骨表面。继续降低注射器制其穿过硬脑膜。之后,继续深入注射器直至到达脑实质的理想深度。
  • 设置数字泵参数为0.02 ml/min(0.5 ul体积在25 min内注射完成)并开始输液。缓慢输液可使病毒有效达到组织内部以防回流。
  • 注射完成后,需等待5 min以保证注射物扩散到大脑而不是回流到注射器中。
  • 缓慢移出注射器。

6. 伤口缝合和恢复

  • 用湿润棉签清洁注射点。较小的开颅创口(小于1 mm×1 mm)无需使用骨蜡;对于较大的颅骨创口,需要在颅骨表面涂抹一层骨蜡。
  • 拉紧皮肤边缘,在三个不同的点对皮肤进行缝合。
  • 将实验动物安置在可进行温控的笼子中直到伤口完全恢复(手术后至少2周)。然后把动物转移回原来的笼子。