斑马鱼基因表达Tol2转座载体

概述

我们的Tol2载体系统可以非常有效地将外源DNA插入到宿主细胞的基因组中。该系统技术简单,利用质粒转染或电转的方法可将您感兴趣的基因永久整合到宿主基因组中。

该系统来源于Tol2转座子,它最初是从硬骨鱼青鳉鱼(Oryzias latipes)中分离出来的。 基于序列同源性分析,发现Tol2转座子与整个脊椎动物基因组中发现的非自主元件的hAT家族密切相关。

Tol2系统包含两个载体,一个载体被称为辅助质粒,负责编码转座酶;另一个载体被称为转座子质粒,包含两个反向末端重复序列(ITRs)以及两者之间的转座区域,需要被转座到宿主基因组中的目的基因就克隆在这个区域。

当辅助质粒和转座子质粒共转染靶细胞时,辅助质粒产生的转座酶将会识别转座子的两个ITR,然后将被转座区和两个ITR元件插入到宿主基因组中。Tol2转座子在宿主细胞中的插入位点没有明显碱基偏好性,这不同于具有特定靶标位点的转座子系统。如,piggyBac转座插入通常发生在包含TTAA序列的宿主染色体位点。

Tol2是II类转座子,通过“剪切—粘贴”的机制移动,从一个地方转座到另一个地方,而不留下序列本身(恰好相反,I类转座子是通过“复制—粘贴”的方式移动)。Tol2通过“剪切-粘贴”机制以单拷贝进行整合,在每一个插入位点都会产生一个8 bp的重复序列。

有两种途径可将转座酶导入靶细胞。第一种是将辅助质粒瞬时转染到细胞中,使转座酶的瞬时表达。 第二种是利用辅助质粒体外转录出Tol2 mRNA,然后注射到靶细胞中。无论哪种情况,转座酶都只能短时间表达。 随着辅助质粒的丢失或转座酶mRNA的降解,转座子会永久整合到宿主基因组中。如果将Tol2转座酶重新导入细胞中,整合的转座子会再次通过“剪切—粘贴”的机制移动。

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Genome Biol. 8(Suppl 1): S7 (2007) Review of Tol2 vectors.
Genetics 174: 639 (2006) Identification of minimal sequences for Tol2 transposable elements.
PLoS Genetics 2: e169 (2006) Large cargo-capacity transposition with a minimal Tol2 transposon.

亮点

Tol2转座子载体系统可将高达11 kb的序列有效插入到靶细胞基因组中。我们的Tol2转座子载体与辅助质粒是经过优化的,可在大肠杆菌中高拷贝复制。该载体系统对多种类型的靶细胞均具有高效的转导效率,实现外源基因的高水平表达。

优势

外源基因的永久整合:常规质粒转染只能实现外源基因的瞬时表达,这种外源基因会随着宿主细胞的分裂而不断丢失,在快速分裂的细胞中显得尤为显著。相反,将Tol2转座子载体和辅助质粒(或者Tol2 mRNA)一起转染到哺乳动物细胞中,由于转座子在转座酶的作用下,目的基因能稳定地整合到宿主细胞的染色体中,从而实现转座子载体上携带的目的基因在宿主细胞中永久表达。

技术简单:通过常规转染即可把质粒转入细胞,相比起病毒载体需要进行病毒包装,过程更简单。

载体容量大:我们的转座子载体总容量可达11 kb,其中质粒骨架只占3 kb,有足够大的容量可以放置客户所感兴趣的序列。

不足之处

转染细胞类型受限:Tol2载体进入细胞依赖于转染。不同类型的细胞,其转染效率差异非常大。非分裂细胞通常比分裂细胞更难转染,原代细胞比永生化细胞更难转染,一些重要的细胞类型转染难度更大,如神经元和胰岛β细胞。另外,质粒转染主要局限于体外应用,很少应用于体内实验(但可以应用于转基因动物模型制备)。以上因素在一定程度上制约了Tol2系统的应用。

载体关键元件

5' ITR: Tol2 5' terminal repeat. When a DNA sequence is flanked by two ITRs, the Tol2 transposase can recognize them, and insert the flanked region including the two ITRs into the host genome.

Promoter: The promoter driving your gene of interest is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. This is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

3' ITR: Tol2 3' terminal repeat. When a DNA sequence is flanked by two ITRs, the Tol2 transposase can recognize them, and insert the flanked region including the two ITRs into the host genome.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.