相关服务
载体构建 
质粒DNA制备 
病毒包装服务 
mRNA基因递送解决方案 
CRISPR基因编辑解决方案 
shRNA基因敲低解决方案 

哺乳动物shRNA干扰scAAV载体

概述

通俗名称:scAAV shRNA干扰载体,scAAV shRNA knockdown vector

VB系统名称:哺乳动物shRNA干扰scAAV载体,mammalian shRNA knockdown scAAV vector

我们的scAAV(self-complementary adeno-associated virus,中文名为双链腺相关病毒或者自我互补腺相关病毒)shRNA干扰载体系统是一种有效敲低哺乳动物蛋白基因表达水平的工具,可用于体外培养细胞、动物体内实验。

scAAV是基于ssAAV(adeno-associated virus,中文名为腺相关病毒,简称AAV或者ssAAV)改造而成的一种病毒基因组是自我互补型双链DNA的AAV。由于野生型的AAV的病毒基因组是single-stranded DNA,与scAAV区分时,往往写成ssAAV。ssAAV病毒颗粒感染细胞后,必须借助宿主细胞的DNA聚合酶复制出第二条链(second strand synthesis)后才能成为有转录功能的dsDNA(double-stranded DNA,双链DNA)。除了第二条链合成途径,多个ssAAV进到细胞后,部分正链基因组分子和负链基因组分子(plus- and minus-stranded AAV genomes)也能退火形成dsDNA。当AAV载体上的基因组长度小于野生型AAV基因组长度的一半,包装出的病毒颗粒也会出现含有二聚体形式的基因组(dimeric genome),而不是单聚体基因组(monomeric genome)。这些病毒转导细胞后,二聚体形式的基因组自行退火形成dsDNA,从而绕过了第二条链合成的这一步限速步骤。为了进一步增加病毒二聚体基因组的量,我们将AAV载体的3’ ITR(Inverted terminal repeat)中的trs序列(terminal resolution site)删除。缺失了trs序列的3’ ITR使AAV载体在病毒包装时能复制出一条中央有一个突变型ITR而两端是野生型ITR的,而左半序列与右半序列是反向重复的病毒基因组分子。感染细胞后,反向重复的两半序列通过分子内碱基配对,最终这条单链DNA能自我折叠形成dsDNA。这样的载体称之为scAAV载体。

图1. ssAAV和scAAV基因组形成路径

与其他常用病毒相比,腺相关病毒具有以下特点:

  • 低免疫原性(low immunogenicity,AAV在人类和其他灵长类动物中非常普遍)
  • 安全(strong safety record,AAV对人类没有致病性)
  • 结构简单(simple structure,AAV是一层衣壳蛋白包裹着一条4.7 kb长的单链DNA的二十面体颗粒)
  • 个头小(small size,发现至今,最小的非包膜病毒)
  • 相对稳定(high stability,与慢病毒相比,AAV看起来更像一个巨大的蛋白分子,MW= ~5,200,000,能耐受一定范围的pH、温度、盐浓度等环境变化)

故腺相关病毒载体是基因治疗的理想工具,已被广泛用于动物实验和临床试验。

研究某个基因功能,往往从获得基因功能(gain of function)和缺失基因功能(loss of function)两个方向设计实验。虽然近年涌现了CRISPR等新技术,shRNA干扰技术依然是基因功能缺失的热门技术。与CRISPR基因敲除不同,shRNA特异性打靶mRNA,不会改变靶细胞的基因组序列。与CRISPRi基因沉默不同,shRNA能特异性打靶一个基因的某一条mRNA。shRNA表达后,被加⼯成small interfering RNA(siRNA)。这些siRNA与RNA-induced silencing complex(RISC)结合,找到与siRNA的反向链完全互补的mRNA分子,接着剪切mRNA,从而抑制mRNA编码的蛋白翻译表达。

图2. shRNA打靶机制

我们的scAAV shRNA干扰载体在两个ITR之间含有两个基因表达盒子。上游基因是Pol III启动子驱动的shRNA表达盒子,而下游基因是Pol II启动子驱动的荧光标记基因表达盒子。在哺乳动物细胞中,Pol II RNA聚合酶一般转录mRNA序列,而small RNA分子通常都是Pol III RNA聚合酶负责转录的。shRNA序列通常只有几十bp,必须使用转录small RNA的Pol III启动子,如人U6启动子。下游marker基因则使Pol II启动子,如CMV启动子。AAV包装时的ITR序列来源于AAV2,这是一种常用的AAV载体构建方式,不影响血清型。另一方面,决定血清型的衣壳蛋白基因由Rep/Cap包装质粒编码。

图3. scAAV shRNA干扰载体结构图

从载体构建到病毒转导的简略流程:

1. 将shRNA序列插入骨架载体,构建成最终载体后,转化到E. coli进行质粒扩增。

2. 将转移质粒(含有ITR序列的AAV载体)、Rep-cap质粒和adenoviral helper质粒一并转染至包装细胞(例如293T细胞),这一步通常叫triple trasnfection。在包装细胞里,转移载体负责病毒基因组DNA的复制,Rep-cap质粒负责表达出Rep功能蛋白和Cap结构蛋白,adenoviral helper质粒负责表达出辅助包装的蛋白。此时,scAAV shRNA干扰载体上的两个ITR之间的序列会被包装进Cap结构蛋白组成的衣壳里,成为含有病毒基因组DNA的病毒颗粒。

3. 一旦scAAV病毒感染细胞,病毒DNA会释放并转运至细胞核。在细胞核中,AAV dsDNA与宿主RNA聚合酶结合,转录出shRNA分子,打靶宿主靶基因的mRNA。

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献:

参考文献主题
Expert Rev Hematol. 4:539 (2011)Progress and challenges of scAAV vectors in gene therapy
Mol Ther. 16:1648 (2008)Review on advances and applications of scAAV vectors
Gene Ther. 10:2112 (2003)Generation of scAAV vectors by mutating AAV terminal repeat
优势

高效:与传统ssAAV病毒不同,scAAV病毒能避开第二条链合成这步限速步骤,高效表达外源基因。

安全性:AAV是至今最安全的工具病毒。无论ssAAV载体,还是scAAV载体,产生的病毒都是复制缺陷型的,不会引起任何人类疾病。

不破坏宿主细胞DNA:转导细胞后,AAV在细胞核保持着游离DNA(episomal DNA)的状态。因此,无论ssAAV载体,还是scAAV载体,产生的病毒都不会整合进细胞DNA,从而避免插入突变。

相对长时间的外源基因表达:游离的AAV dsDNA在细胞核内可存数周,有些甚至数月。因此,U6启动子持续表达shRNA,能长期敲低目的基因的表达水平。

不同血清型感染不同组织细胞:不同血清型的AAV病毒具有不同的组织亲和性。当AAV载体(无论ssAAV,还是scAAV)与不同血清型的Rep-cap质粒搭配包装病毒时,生产出不同血清型的AAV病毒。

不足之处

有限的货物装载能力:理论上,scAAV载体的装载能力只有ssAAV的一半。因此,scAAV载体上ITR之间只能插入小于2.2 kb的外源序列。而ssAAV载体最长能装4.7 kb外源序列。

载体元件

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wild type virus, 5' ITR and 3' ITR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome pointing in opposite directions, where they serve as the origin of viral genome replication.

U6 Promoter: Drives expression of the shRNA. This is the promoter of the human U6 snRNA gene, an RNA polymerase III promoter which efficiently expresses short RNAs.

Sense, Antisense: These sequences are derived from your target sequences and are transcribed to form the stem portion of the “hairpin” structure of the shRNA.

Loop: This optimized sequence is transcribed to form the loop portion of the shRNA “hairpin” structure.

Terminator: Terminates transcription of the shRNA.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early enhancer/promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

3' ITR-Δtrs: AAV 3' ITR with a deleted terminal resolution site. The presence of the mutated 3’ITR leads to the generation of single-stranded, inverted repeat genomes with a mutated ITR in the middle and a wild type ITR at each end. This facilitates intramolecular base pairing within the mutant ITR extending through the genome resulting in the folding of the viral DNA to form a double-stranded molecule.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.