果蝇基因表达att位点整合载体pUASTattB

概述

我们的pUASTattB载体系统是一个高效的转基因果蝇制备和基因表达控制系统。该系统利用噬菌体φC31整合酶介导的重组实现靶向基因有效插入,并结合强大的诱导型启动子Gal4调节转基因表达。pUASTattB载体系统类似于pUAST系统,然而它是利用φC31整合酶介导重组而不是基于P元件的转座实现目的基因的插入。

噬菌体φC31整合酶能高效介导噬菌体附着位点(称为attP)和细菌附着位点(称为attB)之间的序列特异性重组。与基于转座子系统(如P元件介导的重组)相反,φC31介导的插入是不可逆的。pUASTattB整合到attP位点后会产生两个新的位点(attL和attR),新的位点将不再被φC31整合酶识别。另外,基于φC31的插入是具有位点特异性的,通常仅在attP位点发生。基于这个原因,pUASTattB载体系统通常用于携带attP“着陆位点”的果蝇系。

pUASTattB系统包含两个载体,一个称为pUASTattB载体或是携带attB位点和目的基因的φC31供体载体;另一个为编码φC31整合酶的辅助载体。当pUASTattB和φC31辅助质粒共同注射到含有attP位点的细胞时,φC31整合酶介导attB和attP位点之间发生重组,导致pUASTattB载体线性化并整合到宿主基因组中。 mini white基因的表达,可以使果蝇的眼色发生变化,是鉴定转基因果蝇成功与否的标记。

将φC31整合酶引入果蝇宿主有多种方法,可以使用体外转录产生的φC31整合酶mRNA注射靶细胞,也可以将表达φC31整合酶的辅助质粒与pUASTattB载体一起共注射到细胞中。此外,也可以利用φC31整合酶果蝇系实现基因的高效插入。

在pUASTattB系统中,目的基因将被克隆到合成诱导型启动子的下游,该启动子由5个串联排列的GAL4结合位点(5xUAS)和hsp70 TATA box组成。目的基因依赖于GAL4的表达,GAL4蛋白在与pUAST质粒上的UAS位点结合后会激活目的基因的转录。因此,在没有GAL4表达的情况下,目的基因保持沉默,但是通过与表达GAL4的果蝇系杂交后,在GAL4表达的细胞中,目的基因会被转录激活。

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Development. 118:401 (1993) Development and use of the pUAST inducible promoter system
Proc Natl Acad Sci U S A. 97:5995 (2000)
Proc Natl Acad Sci U S A. 95:5505 (1998)
Description of the φC31 integrase system
Proc Natl Acad Sci U S A. 104:3312 (2007) Use of pUASTattB and germ-line-specific φC31 integrase to construct transgenic Drosophila
亮点

我们的pUASTattB果蝇基因表达载体可有效实现φC31整合酶介导的基因插入或目的基因GAL4依赖性表达。我们的载体在大肠杆菌中具有高拷贝,可用于高效产生转基因果蝇。

优势

特定位点插入:基于φC31的插入具有位点特异性,通常仅发生在attP位点,降低了破坏内源基因或插入位点不当影响转基因表达的风险。

高水平表达:5×UAS/mini_Hsp70启动子可以在诱导状态下使目的基因高水平表达。

选择性表达: 不存在GAL4的情况下,目的基因的转录水平很低或没有;在GAL4的存在下,则能实现高水平的基因转录。

高效:使用φC31整合酶实现种系转基因比基于P元件的载体系统如pUAST更有效。

不足之处

潜在的泄漏表达:在某些情况下,即使没有GAL4,目的基因也会发生低水平泄漏表达。

技术复杂:转基因果蝇的产生需要胚胎注射和飞行饲养,具有一定的技术复杂性。

需要attP插入位点:使用pUASTattB载体系统制备转基因果蝇,需要使用基因组中携带attP“着陆位点”的特异宿主。

载体关键元件

5×UAS/mini_Hsp70: The Drosophila melanogaster heat shock protein 70 (Hsp70) minimal promoter fused with five tandem galactose upstream activating sequences (5×UAS). This is a strong promoter, tightly inducible by GAL4.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

SV40 terminator: Simian virus 40 transcriptional terminator. Contains the SV40 small T intron and the SV40 early polyadenylation signal.

attB site: The bacterial attachment site, attB, recognized by the bacteriophage φC31 serine integrase. φC31 integrase can catalyze site-specific integration of attB-containing plasmids into attP-containing docking or landing sites that have been introduced into host genomes.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

mini-white: A variant of the Drosophila white gene. The mini-white gene is a dominant marker for adult fruit fly eye color, which can be used as a reporter to identify transgenic events in a white mutant background.