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载体指南

Sleeping Beauty转座载体

概述

我们的睡美人(Sleeping beauty)转座载体系统可以高效地将外源DNA插入宿主细胞基因组。该系统在技术上十分简洁,仅需要进行质粒转染(无需病毒转导)即可永久性地对宿主细胞基因组插入您的目的基因。

该载体的转座子系统来源于Tc1/mariner转座子超家族,一开始是从鱼类基因组分离出来,并且经过了大量的累积突变已失去转座子活性。睡美人转座子通过移除鲑鱼基因组的Tc1/mariner转座子上的这些失活突变,重新构筑出有活性的转座子。该方法合成的转座子提供了一种在脊椎动物中高效地进行基因转导和插入突变的手段。

睡美人转座载体系统包含两个载体,均为大肠杆菌质粒形式。第一个是辅助质粒,编码转座酶。另一个则是转座子质粒,包含由两个反向/正向重复序列(IR/DR)包围的转座子区域。需要被递送至宿主细胞的外源基因被克隆至该区域。

当辅助质粒和转座子质粒共转染至靶细胞时,辅助质粒表达的转座酶会识别IR/DR序列,然后将两个IR/DR序列之间的区域作为转座子插入宿主基因组上的TA二核苷酸位点。

睡美人转座子是II类转座子,这意味着其遵循剪切-复制的转座机制,从一个地方转移序列至另一个地方不会留下多余的序列拷贝(I类转座子则遵循复制-粘贴机制)。由于辅助质粒是瞬时转染的,会随着时间逐渐丢失。伴随辅助质粒的丢失,插入宿主基因组的转座子将变成永久性的。如果此时再次转染辅助质粒,转座子则可以从宿主基因组中剪切出来,且不会在基因组上留有痕迹。

关于该载体系统的更多信息,请参考以下文献。

参考文献 主题
Cell. 91:501 (1997) Molecular reconstruction of the sleeping beauty transposon
Mol Ther. 8:108 (2003) Gene transfer into genome of human cells by sleeping beauty transposon
Mol Ther. 9:147 (2004) Review on biology & applications of sleeping beauty transposon
亮点

我们的睡美人转座子质粒与其辅助质粒经过优化,在大肠杆菌中以高拷贝数方式复制,并且可以有效转染范围广泛的靶细胞以及高水平表达载体上携带的目的基因。

优势

转座子DNA永久整合:传统的质粒瞬转,转染的质粒再宿主细胞中会逐渐丢失,特别是分裂型的细胞。但是使用睡美人转座子载体连同辅助载体共转染哺乳动物细胞可以实现转座子DNA在宿主细胞基因组的永久整合。

技术简单:常规转染即可把质粒转入细胞,相比起病毒载体需要进行病毒包装,过程更简单。

不足之处

可转染的细胞类型受限:不同类型细胞的质粒转染效率差异很大。非分裂细胞比分裂细胞更难转染,原代细胞比永生化细胞系更难转染。一些重要的细胞类型更是难以转染,如神经元和胰岛β细胞。另外,质粒转染局限于体外细胞实验,很少运用到活体实验。这些问题限制了睡美人转座子载体系统的应用。

转座子容量有限:转座子的容量需在1.9 – 7.2 kb之间,超出该长度的转座子其转座效率会降低。

载体关键元件

IR/DR(L): Inverted/direct repeats of sleeping beauty transposon (Left). Recognized by sleeping beauty transposase; DNA flanked by IR/DR(L) and IR/DR(R) can be transposed by sleeping beauty transposase into TA dinucleotide sites.

Promoter: The promoter driving your gene of interest is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

IR/DR(R): Inverted/direct repeats of sleeping beauty transposon (Right). Recognized by sleeping beauty transposase; DNA flanked by IR/DR(L) and IR/DR(R) can be transposed by sleeping beauty transposase into TA dinucleotide sites.

TATA: TA dinucleotide base-pairs. Increases sleeping beauty transposition efficiency.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.